MYOC基因在原發(fā)性開角型青光眼發(fā)病過程中的作用研究.pdf

1、目的： 青光眼是繼白內(nèi)障之后的第二位致盲眼病，原發(fā)性開角型青光眼(primary open—angle glaucoma，POAG)是青光眼的主要和常見類型之一，POAG的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，傾向于認(rèn)為遺傳因素是主要病因之一。1993年Sheffield等在一個青少年發(fā)病的POAG家系成員的DNA全基因組搜索中，發(fā)現(xiàn)了小梁網(wǎng)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)反應(yīng)蛋白基因突變的。1997年，Polansky等在研究激素性青光眼時，發(fā)現(xiàn)了一個隨著使用

2、糖皮質(zhì)激素作用時間的延長而表達(dá)增多的基因，它最初被命名為糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的小梁網(wǎng)反應(yīng)蛋白(trabecular meshwork inducible glucocorticoid response protein，TIGR)基因，1997年Stone等的研究最終確定了TIGR基因是原發(fā)性開角型青光眼的致病基因，從此，對青光眼致病基因的研究開展迅速、普遍。同年，TIGR基因被基因命名委員會(Genome Database Nomenclat

3、ure Committee，GDNC)正式命名為Myocilin(MYOC)基因。最近的研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)小梁網(wǎng)的myocilin蛋白量過多(分泌過?；蚪到鉁p少)，可能阻塞小梁網(wǎng)房水外流導(dǎo)致房水流出阻力增加；突變形式的myocilin蛋白無法被分泌和降解，大量異常的myocilin蛋白沉積在小梁網(wǎng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，通過細(xì)胞凋亡和/或ECM重排，影響到房水外流，使眼內(nèi)壓升高。

4、MYOC/TIGR基因受糖皮質(zhì)激素調(diào)控，在糖皮質(zhì)激素的誘導(dǎo)下表達(dá)水平顯著上升，導(dǎo)致myocilin蛋白聚集；另外，有文獻(xiàn)報道，糖皮質(zhì)激素體外作用于小梁網(wǎng)細(xì)胞可以造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及ECM重排，細(xì)胞的粘附、吞噬能力下降及細(xì)胞周期改變，由此可以看出，激素處理的體外培養(yǎng)的小梁網(wǎng)細(xì)胞其產(chǎn)生的病理生理變化與文獻(xiàn)報道的POAG的小梁網(wǎng)細(xì)胞的病理改變極為相似，因此，我們采用地塞米松處理體外培養(yǎng)的小梁網(wǎng)細(xì)胞，以便制作出近似POAG發(fā)病的病理生理改變，并運(yùn)用si

5、RNA干擾技術(shù)探討MYOC基因在POAG發(fā)病過程中的作用。 方法： 1、大鼠小梁網(wǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定： 將體外培養(yǎng)的3代小梁網(wǎng)細(xì)胞用于細(xì)胞鑒定及實驗。細(xì)胞免疫組織化學(xué)鑒定：3代細(xì)胞達(dá)到融合以后，進(jìn)行抗兔的纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、層粘連蛋白(laminin，LN)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron—specific enolase，NSE)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。 2、地塞米松培養(yǎng)大鼠

6、小梁網(wǎng)細(xì)胞、培養(yǎng)后MYOC基因表達(dá)量的改變及細(xì)胞凋亡率檢測： 3代的大鼠小梁網(wǎng)細(xì)胞，用終濃度為10-7M地塞米松的15％FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，觀察地塞米松處理后的細(xì)胞數(shù)目、形態(tài)、凋亡率的變化情況，并運(yùn)用Real-Time PCR方法檢測MYOC基因表達(dá)量的改變。 3、檢測MYOC基因作用： (1)MYOC突變分析：運(yùn)用RT-PCR方法擴(kuò)增MYOC基因的cDNA，測序，并進(jìn)行突變分析。 (2)siRNA干擾

7、技術(shù)：設(shè)立三個組別，分別為空白組，空質(zhì)粒干擾組及地塞米松處理組，運(yùn)用siRNA干擾各個實驗組的大鼠小梁網(wǎng)細(xì)胞，觀察siRNA干擾后地塞米松處理組與正常細(xì)胞組比較后的細(xì)胞數(shù)目、形態(tài)、凋亡率的變化情況。 結(jié)果： 1、大鼠原代小梁網(wǎng)細(xì)胞倒置顯微鏡觀察結(jié)果 組織塊接種后5～10天，開始有細(xì)胞從組織塊邊緣向外生長或者在組織塊周圍見數(shù)個游離的細(xì)胞群落。顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)多樣：梭形，橢圓形，不規(guī)則形等，細(xì)胞體積較大。細(xì)胞形態(tài)介于

8、上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間。原代細(xì)胞生長緩慢，一般需要10～15天才能達(dá)到融合，形成單層貼壁細(xì)胞，融合以后細(xì)胞形態(tài)逐漸接近。 2、傳代的大鼠小梁網(wǎng)細(xì)胞倒置顯微鏡及透射電鏡結(jié)果 (1)倒置顯微鏡觀察：傳代的大鼠小梁網(wǎng)細(xì)胞形態(tài)一致，多呈梭形，類似成纖維細(xì)胞形態(tài)，融合以后細(xì)胞密度較高，細(xì)胞體緊密相連，可以形成漩渦狀匍匐生長的單層貼壁細(xì)胞，高倍下可以看到細(xì)胞胞體較大，胞質(zhì)豐富，胞體多突起。傳代細(xì)胞生長較快，多在5～7天便可以融合。

9、 (2)透射電鏡觀察：大鼠小梁網(wǎng)細(xì)胞胞體多突起，表面微絨毛多見。細(xì)胞核呈圓形、橢圓形，位于細(xì)胞中央，邊緣常見凹陷，核仁明顯，核膜清晰，核內(nèi)染色質(zhì)呈細(xì)顆粒狀分散不均勻，密度較高。胞質(zhì)內(nèi)溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體豐富，并且含有大量的微管及微絲，且多在細(xì)胞核附近。 3、培養(yǎng)細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定結(jié)果 (1)纖維粘連蛋白染色：小梁網(wǎng)細(xì)胞染色陽性，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，顆粒狀，有些彼此相連呈網(wǎng)狀。 (2)層粘連蛋白染色：

10、小梁網(wǎng)細(xì)胞染色陽性，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，顆粒狀，也可彼此連接成網(wǎng)狀。 (3)神經(jīng)元特異性烯醇化酶染色：小梁網(wǎng)細(xì)胞染色陽性，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，顆粒狀，也可彼此連接成網(wǎng)狀。 4、細(xì)胞生長曲線： 細(xì)胞增殖速度并不是按直線增加，到7天增殖速度開始減慢，細(xì)胞數(shù)目變?yōu)槠脚_期。 5、10-7M地塞米松培養(yǎng)7天后細(xì)胞倒置顯微鏡及透射電鏡結(jié)果 (1)倒置顯微鏡：與未干擾前正常細(xì)胞相比，細(xì)胞密度降低，形態(tài)變化不大，但細(xì)胞有

11、收縮的趨勢。 (2)透視電鏡：細(xì)胞出現(xiàn)凋亡改變，包括細(xì)胞核固縮，細(xì)胞核內(nèi)細(xì)胞質(zhì)邊集，細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞器腫脹，微管微絲溶解甚多，核周可以出現(xiàn)空泡區(qū)域等等。 6、地塞米松培養(yǎng)小梁網(wǎng)細(xì)胞的MYOC基因測序結(jié)果 RT-PCR擴(kuò)增出1872bp的cDNA片段，包括全長功能區(qū)的1509bp堿基序列，測序后的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫對比分析符合率>99％，沒有發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。 7、正常細(xì)胞組、地塞米松處理組、地塞米松

12、培養(yǎng)細(xì)胞siRNA干擾組MYOC基因表達(dá)量分析real-Time PCR結(jié)果： (1)MYOC基因的干擾率最高可達(dá)85.8％。 (2)正常小梁網(wǎng)細(xì)胞MYOC基因相對含量為約為(1.87±0.09)×10-2pg(Mean±Std)；地塞米松培養(yǎng)的小梁網(wǎng)細(xì)胞MYOC基因表達(dá)相對含量約為(28.93±1.20)×10-2pg(Mean±Std)；地塞米松培養(yǎng)組是正常細(xì)胞細(xì)胞組含量的15.47±0.70倍(Mean±Std)；

13、兩組細(xì)胞MYOC基因表達(dá)量對比*p<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 (3)地塞米松培養(yǎng)后siRNA干擾組MYOC基因的相對表達(dá)量為(5.22±0.66)×10-2pg(Mean±Std)；Dex培養(yǎng)細(xì)胞對照組表達(dá)量為(28.32±0.70)×10-2pg(Mean±Std)；兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗，p<0.05，說明兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 8、正常組，地塞米松培養(yǎng)組及地塞米松培養(yǎng)細(xì)胞siRNA干擾后細(xì)胞組凋亡率結(jié)果：

14、正常3代小梁網(wǎng)細(xì)胞的凋亡率為4.50±0.41％(Mean±Std％)；Dex培養(yǎng)的小梁網(wǎng)細(xì)胞的凋亡率為29.35±0.47％(Mean±Std％)；干擾后的Dex培養(yǎng)組細(xì)胞凋亡率為25.51±1.02％(Mean±Std％)；兩兩進(jìn)行t檢驗，p<0.05，每兩組之間的差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 1、大鼠小梁網(wǎng)細(xì)胞可以作為MYOC基因體外研究的手段 2、地塞米松不能導(dǎo)致體外培養(yǎng)的小梁網(wǎng)細(xì)胞的MYOC基因產(chǎn)生突