間充質(zhì)祖細(xì)胞源性神經(jīng)元樣細(xì)胞體內(nèi)移植延緩骨骼肌萎縮的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、外周神經(jīng)損傷后骨骼肌發(fā)生嚴(yán)重萎縮抑或損傷神經(jīng)修復(fù)后肌肉功能難以恢復(fù)的患者在臨床上較為常見(jiàn)，并且治療相當(dāng)困難。深入闡明失神經(jīng)性骨骼肌萎縮的機(jī)理，有效地延緩或防治其萎縮，最大程度地維持骨骼肌原有功能，是近年來(lái)研究的重點(diǎn)和亟待解決的難題。顯微外科技術(shù)的廣泛應(yīng)用盡管能提高外周神經(jīng)損傷的修復(fù)水平，但術(shù)后骨骼肌功能恢復(fù)并不十分理想，其根源在于周圍神經(jīng)損傷后，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)再生非常緩慢，當(dāng)受損神經(jīng)通過(guò)再植或重新長(zhǎng)入所支配的靶肌肉時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間失神經(jīng)支配所致的肌

2、肉不可逆變化（如肌肉萎縮、纖維化等）使骨骼肌無(wú)法恢復(fù)正常功能。為防治失神經(jīng)性骨骼肌萎縮，國(guó)內(nèi)外學(xué)者采取了許多方法，包括功能性電刺激、被動(dòng)運(yùn)動(dòng)、藥物療法、神經(jīng)元植入、生長(zhǎng)因子治療、基因治療等，盡管實(shí)驗(yàn)研究均取得了一定成功，但臨床應(yīng)用的療效卻有限。
　　干細(xì)胞(stem cell，SC)是一類具有自我增殖能力與多向分化潛能的細(xì)胞，既能產(chǎn)生基因型與自己完全相同的子代細(xì)胞，也能分化為祖細(xì)胞，具有再生為各種組織、器官的潛能，故醫(yī)學(xué)界稱其為“

3、萬(wàn)用細(xì)胞”。“研究表明，成體干細(xì)胞(adult stem cells，ASCs)在自然條件下通常傾向于分化為所屬組織的各種細(xì)胞類型，主要用于替換衰老死亡的細(xì)胞和維持機(jī)體新陳代謝的相對(duì)穩(wěn)定，但在特定的外界誘導(dǎo)條件下，一種組織的成體干細(xì)胞可以“橫向分化”為其他組織的功能細(xì)胞，參與組織的損傷修復(fù)。此外，成體干細(xì)胞還可取自于患者的自身組織，通過(guò)定向誘導(dǎo)分化后重新植入患者體內(nèi)避免了免疫排斥的問(wèn)題。正是由于成體干細(xì)胞具有可塑性、旺盛的自我增殖能力及

4、多向分化潛能，且疾病或損傷均能刺激成體干細(xì)胞的增殖和分化，因此一些學(xué)者認(rèn)為成體干細(xì)胞對(duì)于各種神經(jīng)系統(tǒng)損傷將是一種重要的治療措施，并具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　近年來(lái)，一些學(xué)者將神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)及間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)移植于離斷的外周神經(jīng)或直接注入靶肌肉內(nèi)并有效延緩了失神經(jīng)性骨骼肌萎縮，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確實(shí)獲得了成功，但由于足量的神經(jīng)干細(xì)胞獲得途徑相對(duì)有

5、限且擴(kuò)增困難，體外培養(yǎng)的小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞又極易遭受到造血干細(xì)胞的污染而使其增殖效果不理想，尋找新的移植細(xì)胞尤為迫切。新近研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)祖細(xì)胞(mesenchymal progenitor cell，MPCs)可體外定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，同時(shí)間充質(zhì)祖細(xì)胞具有易獲取、易生長(zhǎng)、增殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)，且來(lái)源于密質(zhì)骨，體外培養(yǎng)時(shí)可避免造血干細(xì)胞的污染，故有望成為神經(jīng)干細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞的替代種子細(xì)胞。
　　因此，本課題擬培養(yǎng)GFP轉(zhuǎn)基因

6、C57小鼠密質(zhì)骨碎片來(lái)源MPCS，體外定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞后進(jìn)行神經(jīng)斷離處移植或直接注入靶肌肉內(nèi)，初步探討移植細(xì)胞體內(nèi)原位定植存活情況以及延緩骨骼肌萎縮的作用與機(jī)制，為進(jìn)一步探明其分子機(jī)制、后期臨床應(yīng)用提供理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為法醫(yī)物證學(xué)的個(gè)體識(shí)別方法、神經(jīng)損傷后鑒定時(shí)限及其損傷程度的把握提供了新的思路。
　　本研究?jī)?nèi)容主要包括兩部分:
　　第一部分:間充質(zhì)祖細(xì)胞源性神經(jīng)元樣細(xì)胞肌內(nèi)移植后自身特性的維持。

7、　　目的:
　　體外培養(yǎng)綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因C57小鼠密質(zhì)骨碎片來(lái)源的間充質(zhì)祖細(xì)胞，通過(guò)體外定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞后移植于神經(jīng)斷離處及直接注入靶肌肉中，探討肌內(nèi)移植后能否定植存活并維持其移植前的特性。
　　方法:
　　取3周齡健康GFP轉(zhuǎn)基因C57小鼠后肢長(zhǎng)骨進(jìn)行MPCs培養(yǎng)，利用流式細(xì)胞術(shù)及成骨、成脂定向誘導(dǎo)分化檢測(cè)其純度及多向分化潛能。選取生長(zhǎng)良好的第三代MPCs，神經(jīng)元原代培養(yǎng)上清液進(jìn)行神經(jīng)元及神經(jīng)膠

8、質(zhì)樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，采用免疫熒光染色檢測(cè)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物NSE、NeuN及神經(jīng)膠質(zhì)特異性標(biāo)志物GFAP的表達(dá)情況并收集細(xì)胞，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105/μl細(xì)胞懸液備用;選取12周齡健康C57小鼠24只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為神經(jīng)斷離處+MPC移植組、神經(jīng)斷離處+生理鹽水組、肌肉+MPC移植組、肌肉+生理鹽水組，其中上述各組小鼠右后肢作為實(shí)驗(yàn)側(cè)，左后肢為假手術(shù)側(cè)。參照文獻(xiàn)操作方法，4組小鼠右后肢均切斷坐骨神經(jīng)建立小鼠失神經(jīng)腓腸肌萎

9、縮模型，左后肢儀分離坐骨神經(jīng)但不做切斷處理。神經(jīng)斷離處+MPC移植組和肌肉+MPC移植組:右側(cè)坐骨神經(jīng)切斷處、右側(cè)腓腸肌內(nèi)及左側(cè)對(duì)應(yīng)部位分別注入5μl MPCs懸液;神經(jīng)斷離處+生理鹽水組和肌肉+生理鹽水組:右側(cè)坐骨神經(jīng)切斷處、右側(cè)腓腸肌內(nèi)及左側(cè)對(duì)應(yīng)部位均注入5μl生理鹽水。術(shù)后4周，熒光顯微鏡下觀察肌內(nèi)移植細(xì)胞存活情況，并采用免疫熒光染色檢測(cè)移植細(xì)胞神經(jīng)元特異性標(biāo)志物NSE、NeuN及神經(jīng)膠質(zhì)特異性標(biāo)志物GFAP的表達(dá)情況。
　

10、　結(jié)果:
　　1、通過(guò)小鼠密質(zhì)骨培養(yǎng)獲得的MPCs主要表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞免疫表型CD29、CD44、CD90、CD106，不表達(dá)造血干細(xì)胞免疫表型CD31和CD45，且在體外能夠誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞，提示通過(guò)小鼠密質(zhì)骨培養(yǎng)獲得的MPCs是細(xì)胞同源性好、純度高、排除了造血干細(xì)胞干擾且具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞。
　　2、MPCs經(jīng)神經(jīng)元原代培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)24 h后，大部分細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)NSE、NeuN，少數(shù)細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)GFAP

11、，而對(duì)照組未見(jiàn)確切陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，提示MPCs經(jīng)體外定向誘導(dǎo)分化后具備神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)的某些特性。
　　3、術(shù)后4周，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞均勻分布于肌細(xì)胞間隙;免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)斷離處+MPC移植組和肌肉+MPC移植組右后肢注射部位周圍肌肉組織中大部分移植細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)NSE、NeuN，少量細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)GFAP，而左側(cè)對(duì)應(yīng)部位肌肉組織以及另外兩組均未見(jiàn)明顯陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，提示MPCs源性神經(jīng)元樣細(xì)胞移植于神經(jīng)斷離處及失神經(jīng)支

12、配靶肌中能夠定植存活并很好地維持其移植前特性。
　　結(jié)論:
　　1、成功培養(yǎng)出生長(zhǎng)良好、純度高且具有多向分化潛能的MPCs細(xì)胞。
　　2、MPCs體外可定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞。
　　3、MPCs源性神經(jīng)元樣細(xì)胞肌內(nèi)移植后能夠在原位定植存活并很好地維持其移植前特性。
　　第二部分:間充質(zhì)祖細(xì)胞源性神經(jīng)元樣細(xì)胞體內(nèi)移植延緩骨骼肌萎縮的研究
　　目的:
　　初步探討間充質(zhì)祖細(xì)胞源性神經(jīng)元

13、樣細(xì)胞移植于神經(jīng)斷離處和靶肌肉中延緩失神經(jīng)性骨骼肌萎縮作用及其機(jī)制。
　　方法:
　　取GFP轉(zhuǎn)基因C57小鼠后肢長(zhǎng)骨進(jìn)行MPCs培養(yǎng)及鑒定，選取生長(zhǎng)良好的第三代MPCs，采用神經(jīng)元原代培養(yǎng)上清液進(jìn)行神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化后收集細(xì)胞，生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105/μl細(xì)胞懸液備用。選取C57小鼠48只，隨機(jī)分為對(duì)照組、神經(jīng)斷離組、神經(jīng)斷離處移植組、肌肉移植組，每組12只。參照文獻(xiàn)操作方法，建立小鼠失神經(jīng)腓腸肌萎縮

14、模型，其中對(duì)照組不做任何處理。神經(jīng)斷離處移植組和肌肉移植組分別于坐骨神經(jīng)斷離處、腓腸肌內(nèi)注入5μl MPCs懸液，神經(jīng)斷離組于腓腸肌內(nèi)注入等量生理鹽水，對(duì)照組不作任何處理。觀察小鼠后肢活動(dòng)能力，術(shù)后2和4周測(cè)量腓腸肌濕重、肌纖維橫截面積維持率及觀察超微結(jié)構(gòu)，用Western blot檢測(cè)α-actin、MHC及RT-PCR檢測(cè)Myogenin、MyoD的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1、術(shù)后2和4周，神經(jīng)斷離處移植組和肌肉移植

15、組腓腸肌濕重及肌纖維橫截面積維持率顯著高于神經(jīng)斷離組，提示兩種治療方法均可有效延緩失神經(jīng)性骨骼肌萎縮，其中神經(jīng)斷離處移植組治療效果更顯著。
　　2、術(shù)后4周，神經(jīng)斷離處移植組和肌肉移植組肌細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的退變及肌肉纖維化程度明顯低于神經(jīng)斷離組，且部分細(xì)胞表現(xiàn)出旺盛的增殖活性的特點(diǎn)（細(xì)胞核內(nèi)移，核增大，核仁明顯，異染色質(zhì)發(fā)達(dá)、線粒體數(shù)量增多等），表明兩種治療方法均可有效抑制失神經(jīng)性骨骼肌纖維化;
　　3、術(shù)后4周，We

16、stern blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)斷離處移植組和肌肉移植組腓腸肌內(nèi)α-actin及MHC的表達(dá)程度均顯著高于神經(jīng)斷離組和對(duì)照組，表明兩種治療方法既可有效抑制失神經(jīng)性骨骼肌蛋白質(zhì)的降解，又能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)的加快合成。
　　4、術(shù)后4周，RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)斷離處移植組和肌肉移植組腓腸肌內(nèi)Myogenin及MyoD的基因表達(dá)豐度顯著高于神經(jīng)斷離組和對(duì)照組，其中以MyoD的高表達(dá)更為顯著。
　　結(jié)論:
　　1、MPCs源