大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)外表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子與體內(nèi)移植延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分，大鼠骨髓聞充質(zhì)干細(xì)胞體外向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化及表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:研究大鼠骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞(Ratmesenchaymalstemeells,rMSCs)以及經(jīng)誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞后腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)素-3(NT3)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)的表達(dá)情況。方法:取Wistar大鼠骨髓,提取、分離、培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,

2、用免疫熒光染色及流式細(xì)胞儀行CD44、CD45和CD90鑒定。取傳第3代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用DMEM、0.1mm01/L2一巰基乙醇和2％二甲基亞砜,預(yù)誘導(dǎo)5小時(shí)后更換含10％FBS的DMEM、10ug/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、l0ug/L表皮生長因子(EGF)共lml,置入37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)維持7天和14天,熒光相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),行神經(jīng)元標(biāo)志物Nestin、NF、MAP-2、B-tubulinIil、Ch

3、at和GFAP免疫熒光染色和流式細(xì)胞儀鑒定。分別在細(xì)胞傳l、3、5代及誘導(dǎo)7天和14天時(shí)采用RT-PCR及ELISA測定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞表達(dá)BDNF、NGF、NT3、CNTF和GDNF阿情況。結(jié)果:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后大約有80％的細(xì)胞呈神經(jīng)元樣改變,免疫熒光染色顯示神經(jīng)元標(biāo)志物Nestin陽性率40.17％±2.95％、NF陽性率16.00％±1.23％、MAP-2陽性率36.30％±l.78％、tubulinBII

4、I陽性率19.00％±l.58％、Chat陽性率19.30％±1.38％和GFAP陽性率39.17％±l.95％。RT-PcR顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠表達(dá)BDNF、NGF、NT3、CNTF和GDNF;而ELISA分析證明在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳第3代時(shí)上述神經(jīng)營養(yǎng)因子處于高峰,CNTF表達(dá)量最高,比NT3高15倍;從傳第1代到第5代CNTF表達(dá)變化小于1倍,但是BDNF表達(dá)變化則多于8倍;分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞后表達(dá)上述神經(jīng)營養(yǎng)因子的能力下降,

5、特別是CNTF及BDNF下降至一半;在誘導(dǎo)7天時(shí)NGF、BDNF、GDNF表達(dá)略高于誘導(dǎo)14天,而CNTF、NT3的表達(dá)則比誘導(dǎo)14天時(shí)稍減少。結(jié)論:1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠表達(dá)BDNG,NGF,CNTF,GDNF和NT3,且在細(xì)胞傳第三代時(shí)處于高峰,以CNTF的表達(dá)量最高。2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后為神經(jīng)元樣細(xì)胞后表達(dá)上述神經(jīng)營養(yǎng)因子含量下降,以CNTF及BDNF下降最明顯。3.在誘導(dǎo)7天和14天時(shí),上述神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)量相當(dāng)。<

6、br>　　第二部分，大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子及移植延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植于切斷脛神經(jīng)遠(yuǎn)端觀察表達(dá)上述神經(jīng)營養(yǎng)因子以及向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的情況;進(jìn)一步觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞延緩失神經(jīng)支配的骨骼肌萎縮作用和沉默骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)CNTF對延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的影響。方法:取成年Wistar雄性大鼠,分為4組:I,對照組(n=24);II,CNTF注射組(n=24);III,R

7、NA干擾沉默CNTF表達(dá)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植組(n=24);Ⅳ,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植組(n=24)。每組大鼠的遠(yuǎn)端脛神經(jīng)分別被注射5ulDMEM,5u1CNTF,2.5×105RNA干擾沉默CNTF表達(dá)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和2.5×105骨髓聞充質(zhì)干細(xì)胞。分別于術(shù)后4、8和12周獲取標(biāo)本行腓腸肌張力、腓腸肌濕重比率、腓腸肌纖維橫截面積維持率及三色染色觀察肌萎縮情況;同時(shí)行在12周時(shí)行骨髓基質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、CD90;神經(jīng)元標(biāo)志物N

8、F、GFAP及神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF、NT3、CNTF和GDNF免疫熒光染色觀察骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子與分化情況以及掃描電鏡觀察神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜變化情況。結(jié)果:在移植后4、8和12周崩}腸肌肌張力測試發(fā)現(xiàn),在所有各組肌張力呈持續(xù)下降趨勢,特別是I組;而且腓腸肌濕重比率、腓腸肌纖維橫截面積維掙率下降趨勢與肌張力變化相似;各組問兩兩比較,結(jié)果顯示腓腸肌濕重比率、腓腸肌纖維橫截面積維持率,Ⅳ組與I組、II組比較差異有顯著

9、性(P＜0.05);III組與I組、II組比較差異有顯著性(P＜0.05);II組與I組比較差異有顯著性(P＜0.05);然而,III組與Iv組比較差異無顯著性(P＞0.05)。腓腸肌三色染色發(fā)現(xiàn),I組肌纖維大部分被膠原纖維組織替代,II、III、Ⅳ組尚有肌纖維組織得以保持,其中,Ⅳ組優(yōu)于III組優(yōu)于II組。在細(xì)胞移植后12周取遠(yuǎn)側(cè)脛神經(jīng)標(biāo)本行免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD90呈陽性,同時(shí)行神經(jīng)營養(yǎng)因子:BDNF、NGF、N

10、T3、CNTF和GDNF染色呈陽性,而神經(jīng)元標(biāo)志物NF、GFAP呈陰性。進(jìn)行描電鏡顯示,Ⅳ組神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜皺襞深度與密度優(yōu)于III組優(yōu)于II組優(yōu)于I組。結(jié)論:1.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有延緩失神經(jīng)骨骼肌肌萎縮的作用:;2.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在缺少某種神經(jīng)營養(yǎng)因子-CNTF的情況下延緩失神經(jīng)骨骼肌肌萎縮的作用未發(fā)生改變;3.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞之所以能夠延緩失神經(jīng)骨骼肌肌萎縮可能因?yàn)樵谥車窠?jīng)中存活并分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子,而不是分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞;4

11、.突觸后膜的變化與腓腸肌形態(tài)與功能的變化一致,我們推猜骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)的神經(jīng)營養(yǎng)因子是通過神經(jīng)肌肉接頭處的突觸后膜發(fā)揮延緩失神經(jīng)骨骼肌肌萎縮。
　　第三部分，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對突觸后膜AchR影響及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對突觸后膜AehR表達(dá)的影響及引起其變化的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路情況。方法:將So18肌管細(xì)胞培養(yǎng)于含10％FBS的高糖DMEM中待其達(dá)到60％融合時(shí),通過構(gòu)建慢病毒載體(INTHM)將

12、AchR和:ERBB3共轉(zhuǎn)染So18肌管細(xì)胞,-通過RT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率;將共轉(zhuǎn)染后的So18肌管細(xì)胞與傳第三代的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí);實(shí)驗(yàn)分兩組:A:Sol8肌管細(xì)胞組;B:共培養(yǎng)組:通過Westernblot測定So18肌管細(xì)胞.AehR表達(dá)情況以及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路ERBB3(細(xì)胞膜)一Ras-Raf-MAPK(細(xì)胞質(zhì))的變化情況。結(jié)果:經(jīng)RT-PCR測定發(fā)現(xiàn)Erbb3轉(zhuǎn)染率為84.3％,AChR6轉(zhuǎn)染率為83.3％。W