異丙腎上腺素通過NF-kappaB通路延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮.pdf

1、目的：研究異丙腎上腺素、對核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(nuclear factor of kappaB，NF-kappaB)p65和E3連接酶MAFbx活性的影響，探討各種藥物防治肌萎縮的作用及其機(jī)制。
　　 方法：選擇健康的雄性SD大鼠54只，體重195±5g，隨機(jī)分為A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，H，I9組，每組6只。A組為對照組(假手術(shù)組)，B、C、D，E組為去神經(jīng)組，F(xiàn)、G，H，I為異丙腎上腺素組。大鼠分批用戊巴比妥鈉(40m

2、g/kg，ip)麻醉后，用右下肢后部中段切斷坐骨神經(jīng)的方法制作失神經(jīng)骨骼肌動(dòng)物模型，正常組僅做假手術(shù)(不切斷坐骨神經(jīng))，去神經(jīng)組及異丙腎上腺素組切斷坐骨神經(jīng)1cm以上，分別于去神經(jīng)第2d、7d、14d、28d處死大鼠(用脊椎脫臼法)，用顯微外科技術(shù)認(rèn)真游離失神經(jīng)腓腸肌，切取的肌肉樣本快速置于-80℃冰箱凍存，備用。用RT-PCR法檢測MAFbx與NF-KB的mRNA：以GAPDH作為內(nèi)參照，做半定量檢測。取樣本組織50mg勻漿后用上海生

3、工抽提試劑進(jìn)行總RNA抽提，然后用MBI的RT-PCR試劑盒，按樣本RNA2μg，20μl體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。MAFbx其上游引物：5'cta cga tgt tgc agc caa ga3'，下游引物：5'Ggc agt cga gaa gtc cag tc：3'，共167bp；P65的上游引物：5'gac cag gaa gtc agc gag tc3'下游引物：5'tcc aga ggg acagct ctt gt3'共176bp.作

4、為內(nèi)參照的GAPDH的引物由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，其上游引物：5'tga acg gga agc tca ctg g3'，下游引物：5'tcc acc acc ctg ttg ctg ta3'共307bp.聚合酶鏈反應(yīng)按50μl體系，反應(yīng)條件為：96℃，2'，1cycle。96℃，30"；Tm(Myf-553℃)/(GAPDH50℃)，30"；72℃，2'，36 cycle。用免疫印跡法(Westernblot法)測定MAFbx與N

5、F-KB的蛋白質(zhì)：用β-actin作為內(nèi)參照，做半定量檢測。取樣本組織100mg勻漿后用普利萊蛋白提取試劑盒進(jìn)行總蛋白抽提，煮沸、離心后，加樣于垂直電泳槽行SDS-PAGE，電泳約3h，轉(zhuǎn)膜1小時(shí)30分鐘，封閉室溫4小時(shí)，孵育一抗(Ab1)4℃過夜，漂洗后孵育二抗(Ab2)4℃約4小時(shí)，TBS漂洗后，置于暗室加ECL發(fā)光試劑盒反應(yīng)，一分鐘左右立即放在暗箱曝光，60秒左右取出浸入顯影劑內(nèi)，觀察至最佳顯影后，撈出在清水中洗凈，然后置于定影劑

6、中15分鐘，取出晾干后用數(shù)碼相機(jī)獲取圖片。最后用NIH的ImageJ軟件獲取數(shù)據(jù)，用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：去神經(jīng)骨骼肌萎縮時(shí)，腓腸肌MAFbx、NF-KB的mRNA和蛋白質(zhì)在去神經(jīng)支配后第2d、7d、14d、28d不同時(shí)段表達(dá)均為上調(diào)。NF-KB藥物各組與失神經(jīng)組同時(shí)段比較均下調(diào)(除2d組外)P＜0.05，而MAFbx表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05.
　　 結(jié)論：大鼠失神經(jīng)骨骼肌萎縮早期，MAFbx、N