一種新型表達載體PICET32表達鉤蟲抗凝肽AcaNAP7的研究.pdf

1、[目的]
　　 PICET32是本實驗室構(gòu)建的一種新型表達載體,預(yù)測其可能具有體外高效表達并且獲得活性好的重組蛋白的特性。本實驗將前期得到的犬鉤蟲抗凝肽AcaNAP7插入該新型表達載體中,對重組目的產(chǎn)物蛋白的表達規(guī)律進行了優(yōu)化研究,分析重組AcaNAP7的表達情況并研究其活性,為新型表達載體PICET32應(yīng)用于重組生產(chǎn)鉤蟲抗凝肽奠定基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 1.重組犬鉤蟲抗凝肽PICET32/AcaNAP7的

2、構(gòu)建
　　 設(shè)計引物,擴增AcaNAP7成熟肽編碼基因,克隆入原核表達載體PICET32中,得到重組原核表達質(zhì)粒PICET32/AcaNAP7。同時,利用前期構(gòu)建成功的另一載體PETH作為對照,構(gòu)建重組原核表達質(zhì)粒PETH/AcaNAP7。
　　 2.犬鉤蟲抗凝肽的AcaNAP7原核表達和純化
　　 將構(gòu)建好的重組表達質(zhì)粒PICET32/AcaNAP7和PETH/AcaNAP7,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),利

3、用IPTG誘導目的蛋白表達,SDS-PAGE分析表達情況。通過緩沖液pH值和取樣時間點的改變,摸索PICET32/AcaNAP7最佳自剪切條件。
　　 PICET32/AcaNAP7重組表達產(chǎn)物經(jīng)Ni-IDA親和層析和快速幾丁質(zhì)柱純化,PETH/AcaNAP7重組表達產(chǎn)物經(jīng)Ni-IDA親和層析純化后獲得目的蛋白。
　　 3.目的蛋白AcaNAP7抗凝活性檢測
　　 純化得到的目的蛋白用凝血酶原時間(PT)檢測其體

4、外抗凝活性。
　　 [結(jié)果]
　　 1.重組犬鉤蟲抗凝肽PICET32/AcaNAP7和PETH/AcaNAP7的構(gòu)建
　　 經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定,結(jié)果均表明PICET32/AcaNAP7和PETH/AcaNAP7重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 2.犬鉤蟲抗凝肽的AcaNAP7原核表達和純化
　　 用IPTG能誘導重組蛋白PICET32/AcaNAP7和PETH/AcaNAP7在大腸桿菌中高效

5、表達,表達產(chǎn)物主要以可溶形式存在,每升培養(yǎng)基中目的蛋白的產(chǎn)量分別為79.72mg和33.14mg。其中PICET32/AcaNAP7蛋白上清,通過自剪切率的比較來看,pH6.436h后取樣的樣品自剪切效果最佳。純化得到的重組蛋白純度高達95％。
　　 3.目的蛋白AcaNAP7抗凝活性檢測
　　 PICET32/AcaNAP7和PETH/AcaNAP7兩種重組蛋白3批純化產(chǎn)物100nM的PT值經(jīng)SPSS13.0分析,兩種

6、重組蛋白之間差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。上述兩種重組蛋白延長兩倍正常PT所需的蛋白濃度分別為24.8nM和31.5nM。
　　 [結(jié)論]
　　 用PICET32和PETH兩種載體制備的重組蛋白AcaNAP7在大腸桿菌中可得到高效的可溶性表達,其中PICET32載體表達的目的蛋白的產(chǎn)量明顯高于PETH表達的目的蛋白,可能由于Trx能促進蛋白可溶性表達。PICET32/AcaNAP7蛋白上清于pH6.436h后取樣的