CA16疫苗候選株減毒特性及生產(chǎn)工藝的初步研究.pdf

1、手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是一種在全球范圍內(nèi)流行的急性傳染病，近幾年來，其在亞太地區(qū)的爆發(fā)尤為嚴重。在我國，手足口病已成為危害嬰幼兒健康的重要公共衛(wèi)生問題。
　　柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16，CA16)和腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)是引起手足口病的主要病原體。一直以來，研究人員把工作重點放在了致病率和致死率更高的EV71上，而

2、目前越來越多的研究表明CA16的感染也是導致重癥及死亡病例的重要因素之一。但是目前還沒有針對CA16引起的手足口病的特效治療方案和預防手段。疫苗是控制手足口病的關鍵，本研究對CA16候選株減毒特性和生產(chǎn)工藝進行初步的研究，旨在為其減毒疫苗的開發(fā)奠定基礎。
　　實驗將兩株CA16高免疫原性的毒株經(jīng)過連續(xù)低溫傳代減毒后，進行減毒特性的評價，結果發(fā)現(xiàn)33℃連續(xù)低溫傳代后毒株表現(xiàn)出以下特性(1)減毒候選株保持穩(wěn)定的生長特性，低溫傳至第11

3、代次后KM154株的感染性滴度波動范圍小于0.5LgCCID50/ml;(2)減毒候選株具有良好的免疫原性，以病毒收獲液0.5ml/只的劑量腹腔注射免疫成鼠后以抗體效價大于1∶4為陽性，其抗體陽轉率達100％，從抗體幾何平均滴度(Genometric Mean Titer，GMT)來看，最高可達1∶30;(3)減毒候選株的致病性研究中發(fā)現(xiàn)隨著代次的升高減毒株對乳鼠的致病力減弱，KM154毒株的第12代次(KP12)后感染的乳鼠未見發(fā)病及

4、死亡情況，組織中能檢測到CA16病毒，但無明顯的病理改變;(4)減毒候選株基因序列檢測結果發(fā)現(xiàn)，與初始代次相比，毒株基本保持了遺傳的穩(wěn)定性;(5)交叉保護研究結果顯示，候選株免疫兔后制成的兔抗-CA16血清對所選的14株CA16毒株具有100％的保護作用，而15株EV71株只有一株受保護;(6)在感染了兩個減毒候選株的ICR成鼠（腹腔注射）及乳鼠（顱內(nèi)注射）的腦、脾、腎、肺、肝、心、肌肉、脊髓組織中檢測到CA16病毒，表明病毒能在乳鼠及

5、成鼠組織內(nèi)復制并傳播。
　　本研究還對生產(chǎn)工藝進行了初步的探討。(1)在毒株穩(wěn)定性影響因素的研究中我們發(fā)現(xiàn)，10次以內(nèi)的凍融次數(shù)對CA16毒株的感染性滴度無影響;毒株在-70℃與液氮中儲存8個月后，兩個條件下的毒株感染性滴度相同，均為6.58LgCCID50/ml，與原始相比，基本沒有下降;(2)加入MgCl2和我所甲肝無明膠的凍干保護劑后毒株的感染性滴度下降速率明顯減緩，加入0.5 M MgCl2組至第7天只下降了1.4LgCC

6、ID50/ml。(3)不同純化工藝的探討中我們發(fā)現(xiàn)氯仿抽提對病毒的感染性滴度及抗原含量回收率都較好，且刺激小鼠產(chǎn)生有效的抗體水平，是較理想的病毒純化方法;實驗還發(fā)現(xiàn)蛋白質含量及減毒株感染性滴度對毒株的免疫原性都有影響，蛋白質含量及感染性滴度高的毒株免疫原性好。
　　本研究獲得了具有穩(wěn)定生長特性、良好免疫原性和遺傳穩(wěn)定性，且擁有對CA16廣譜保護作用的CA16減毒候選株，并對毒株熱穩(wěn)定性、純化方法等生產(chǎn)工藝進行了初步摸索，為CA16