G-CSF對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞及其對(duì)缺血缺氧性腦損傷的作用及機(jī)制研究.pdf

1、粒細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)是生長(zhǎng)因子家族的一員,主要功能是刺激定向祖細(xì)胞向中性粒細(xì)胞分化。自上世紀(jì)九十年代開(kāi)始應(yīng)用于臨床,主要用于減少癌癥病人化療后粒細(xì)胞減少后引起的感染,治療嚴(yán)重的先天性粒細(xì)胞減少癥。目前的臨床研究表明,G-CSF是副作用很少,非常安全的一種藥物。G-CSF對(duì)包括神經(jīng)細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞也有營(yíng)養(yǎng)作用。最近的研究表明,G-CSF有神經(jīng)保護(hù)作用

2、,但是G-CSF的神經(jīng)保護(hù)作用的具體分子機(jī)制仍不明確。
　　 本研究組和國(guó)外的一些研究發(fā)現(xiàn),在大鼠腦許多區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞上都有粒細(xì)胞集落刺激因子受體(Granulocyte colony-stimulating factor,G-CSFR)的表達(dá)。研究表明,在嚙齒類(lèi)的中樞系統(tǒng)中,發(fā)生大腦中動(dòng)脈梗塞和再灌注損傷時(shí),神經(jīng)細(xì)胞上G-CSF和G-CSFR的表達(dá)會(huì)上調(diào)。最近的研究發(fā)現(xiàn),G-CSFR在不同發(fā)育程度的大鼠胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多個(gè)區(qū)

3、域均有表達(dá),并且在神經(jīng)前體細(xì)胞和膠質(zhì)前體細(xì)胞上均有表達(dá),這表明G-CSF在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中可能有非常重要的作用。但是,G-CSF對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞有沒(méi)有作用,有什么樣的作用,以及其可能的機(jī)制是什么,至今尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 近年來(lái)關(guān)于G-CSF神經(jīng)保護(hù)作用的研究成果主要集中在兩方面:G-CSF能動(dòng)員CD34+的造血干細(xì)胞從骨髓遷移到外周血,顯著減少梗死的區(qū)域和提高存活率；G-CSF通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡。關(guān)于G-CSF是否

4、可能通過(guò)動(dòng)員內(nèi)源性NSCs的增殖從而促進(jìn)腦損傷的修復(fù)未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此,我們首先在體外分離培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞,采用免疫熒光、Western blot等技術(shù)方法,研究G-CSF對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的作用及作用機(jī)制。在此基礎(chǔ)上,建立了缺血缺氧性腦損傷模型,檢測(cè)G-CSF對(duì)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的作用,從而為臨床上應(yīng)用G-CSF治療神經(jīng)損傷相關(guān)疾病提供了新的理論依據(jù)。
　　 一、體外研究G-CSF對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的作用
　　 于小鼠妊娠后12.5天

5、,應(yīng)用體視顯微鏡成功分離胚胎神經(jīng)管前端腦泡,經(jīng)機(jī)械吹打獲取細(xì)胞懸液,接種于無(wú)血清培養(yǎng)基,獲得神經(jīng)干細(xì)胞(neural stemcells,NSCs)。應(yīng)用5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)標(biāo)記以及巢蛋白(Nestin)免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)其增殖和更新能力,采用神經(jīng)元特異性微管相關(guān)蛋白2(microtubule associated protein2,MAP2)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性膠質(zhì)原纖

6、維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫熒光染色法檢測(cè)了其分化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,獲得的是具有增殖能力和分化潛能的NSCs,可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。我們首先用免疫熒光和RT-PCR方法檢測(cè)了G-CSFR是否在NSCs表達(dá),之后通過(guò)MTT分析法檢測(cè)了G-CSF對(duì)NSCs活性的影響,結(jié)果顯示,G-CSF可提高NSCs的增值活性,而且該作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)關(guān)系,當(dāng)G-CSF的濃度為100 ng

7、/ml時(shí),細(xì)胞的活性最高。后續(xù)采用此濃度研究了G-CSF對(duì)NSCs的增殖和分化作用。研究發(fā)現(xiàn),G-CSF處理組的細(xì)胞增殖率明顯高于對(duì)照組。說(shuō)明G-CSF能促進(jìn)NSCs的增殖。我們還用低濃度FBS的培養(yǎng)基中研究,研究了G-CSF對(duì)NSCs分化的影響,結(jié)果顯示,G-CSF能促進(jìn)NSCs的分化,尤其在培養(yǎng)后第三天和第五天表現(xiàn)更為顯著。
　　 二、G-CSF促進(jìn)NSCs增殖和分化機(jī)制的研究
　　 分別在G-CSF加入后5、15、

8、30、60和75 min收集細(xì)胞,用Western blot方法研究STAT3和p-STAT3蛋白的表達(dá)狀況。結(jié)果顯示,STAT3的表達(dá)在所有時(shí)間點(diǎn)未發(fā)生明顯變化,而活化型STAT3即p-STAT3的表達(dá)則在5 min開(kāi)始升高,至30 min到達(dá)峰值,之后開(kāi)始下降,至75 min接近正常水平。這表明,G-CSF與NSCs表面相應(yīng)受體結(jié)合,能誘導(dǎo)STAT3的快速活化。加入G-CSFR的抗體后,p-STAT3的活化水平和細(xì)胞的增殖率均明顯低

9、于單純G-CSF作用組,而和對(duì)照組水平接近。提示STAT3的活化參與了G-CSF對(duì)NSCs增殖的促進(jìn)作用。
　　 為了研究G-CSF對(duì)NSCs分化的可能機(jī)制,我們應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)了與NSCs分化密切相關(guān)的bHLH家族主要轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化,結(jié)果顯示,Neurogl、NeuroD2、Mashl、Idl和Hes5的mRNA水平與對(duì)照組相比均有顯著升高。其中Neurogl、NeuroD2、Mashl和Idl四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子不僅mR

10、NA水平高于對(duì)照,并且在G-CSF處理組的峰值均比對(duì)照組提前出現(xiàn)。更有趣的是,我們應(yīng)用免疫熒光、Western blot和RT-PCR.等方法研究發(fā)現(xiàn)在無(wú)FBS存在時(shí),G-CSF不能獨(dú)立啟動(dòng)NSCs的分化。
　　 三、缺血缺氧性腦損傷模型的建立及G-CSF神經(jīng)保護(hù)作用的研究
　　 以往的研究顯示,G-CSF有神經(jīng)保護(hù)作用,但其分子機(jī)制不明。本研究采用新生小鼠單側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎后給予低濃度氧氣的方法,建立穩(wěn)定的缺血缺氧

11、性腦損傷(hypoxic ischemic brain damage,HIBD)模型。結(jié)果顯示,G-CSF治療組同側(cè)腦含水量明顯低于HIBD組,海馬區(qū)神經(jīng)元的排列也較HIBD組規(guī)則,凋亡分析發(fā)現(xiàn),G-CSF治療組的細(xì)胞凋亡顯著低于HIBD組,這與其他研究者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在關(guān)于受體表達(dá)研究中,G-CSF治療組G-CSF-R的表達(dá)與MAP2共定位,且表達(dá)顯著高于HIBD組,說(shuō)明G-CSF可促進(jìn)神經(jīng)元上G-CSFR的表達(dá)。為了探討G-CSF

12、抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制,我們檢測(cè)了Bcl-2、Bax和Caspase3的蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,G-CSF處理組Cleaved caspase3和Bax的表達(dá)水平明顯低于HIBD組而B(niǎo)cl-2卻明顯高于HIBD組,提示Caspase3、bax和Bcl-2共同參與了G-CSF對(duì)HIBD后腦細(xì)胞的抗凋亡作用。
　　 四、G-CSF促進(jìn)內(nèi)源性NSCs的增殖的實(shí)驗(yàn)研究
　　 為了探討G-CSF在缺血缺氧性腦損傷中對(duì)內(nèi)源性NSCs的作用,

13、我們分別檢測(cè)了大腦半球皮質(zhì)、海馬、齒狀回(Dentate gyrus,DG)和室管膜下區(qū)(Subventricularzone,SVZ)等區(qū)nestin的表達(dá),G-CSF-R的表達(dá)以及海馬DG區(qū)和SVZ區(qū)細(xì)胞增殖的情況。結(jié)果顯示,G-CSF顯著促進(jìn)nestin在大腦半球皮質(zhì),海馬、DG和SVZ區(qū)的表達(dá),并且G-CSF在HIBD處理后較長(zhǎng)時(shí)間仍能維持SVZ區(qū)nestin的高水平表達(dá),這可能是G-CSF對(duì)缺血缺氧性后小鼠腦有保護(hù)作用的機(jī)制之

14、一。海馬的DG區(qū)nestin和BrdU的雙標(biāo)結(jié)果及SVZ區(qū)的BrdU免疫熒光結(jié)果顯示,G-CSF可促進(jìn)NSCs的增殖。
　　 結(jié)論:
　　 G-CSF能促進(jìn)外培養(yǎng)的NSCs的存活,并表現(xiàn)出一定的劑量依賴(lài)性。G-CSF能促進(jìn)NSCs的增殖,并上調(diào)p-STAT3的蛋白表達(dá)。G-CSF能調(diào)節(jié)NSCs分化相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化。在HIBD模型中,G-CSF能通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)減少神經(jīng)元的凋亡。同時(shí)