基因BC023882發(fā)育學表達模式、亞細胞定位及其對細胞周期的影響.pdf

1、研究背景 前期課題“高密度cDNA基因芯片篩選小鼠腦發(fā)育、損傷相關基因的研究”利用含小鼠發(fā)育文庫cDNA7680條的高密度基因芯片，對發(fā)育和損傷模型中表達差異的基因進行篩選。結果發(fā)現(xiàn)發(fā)育過程中高表達基因560個，其中過度表達有34個。這些基因功能廣泛，涉及轉錄調(diào)節(jié)、信號轉導、細胞代謝、免疫調(diào)節(jié)、細胞骨架、DNA復制修復、細胞粘附等17類。其中一個功能未知的過度表達基因BC023882引人注目，它在胚胎發(fā)育和生后早期小鼠的腦組織存

2、在高表達，其中POd時相點Cy5/Cy3比值(Ratio值)為7.6038，遠遠高于2.0000的基因表達差異篩選標準。提示基因BC023882可能在小鼠早期胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中起到重要作用。 研究方法與結果 1.基因BC023882的發(fā)育學表達模式及腦區(qū)定位。 (1)半定量RT-PCR檢測基因BC203882在發(fā)育小鼠各個階段的表達情況。 分別取小鼠胚胎期時相點(E14、E19d)及生后發(fā)育時相

3、點(P1、P7、P14、P30、P60d)的小鼠組織。其中胚胎期組織包括腦(brain)和胚體(body)，而生后組織包括腦、肝、腎、心、肺和小腸。分別提取上述組織的總RAN，利用RT-PCR技術檢測基因023882在上述組織中的表達。我們通過RT-PCR實驗觀察到基因BC023882的mRNA呈階段性地表達于腦組織，P1d達到高峰，P60d表達消失；其mRNA也少量表達于胚體組織，具體定位有待進一步實驗確定；另外P1d肝組織也有微弱表

4、達，隨后迅速消失，而腎臟、肺、小腸和心臟等組織均未檢測到該基因表達。 (2)用原位雜交技術檢測基因BC023882的mRNA在不同腦區(qū)中的定位。 根據(jù)基因BC023882的特異性序列設計RT-PCR引物，擴增后構建在含T7啟動子的pcDNA3.1(-)載體中，標記cRNA探針。利用該基因探針對各實驗組腦組織進行原位雜交。通過組織原位雜交實驗觀察：基因BC023882的mRNA的最早出現(xiàn)在E14d的胚胎腦組織大腦皮層，包括

5、運動皮層、軀體感覺皮層、扣帶皮質(zhì)和梨狀皮質(zhì)；P1d時雜交陽性細胞出現(xiàn)范圍更廣，如大腦皮層，內(nèi)囊、胼胝體、視前區(qū)諸核團等等；雜交信號在P1d出現(xiàn)高峰，P7d明顯減弱，P30d完全消失；基因BC023882的mRNA主要定位在細胞核內(nèi)，而皮層的少數(shù)神經(jīng)元的胞漿內(nèi)也有出現(xiàn)，神經(jīng)細胞的胞體中未見陽性出現(xiàn)。 2.基因BC023882融合蛋白的亞細胞定位。 我們成功構建了BC023882-EGFP融合蛋白真核表達載體，將該真核表達載

6、體導入COS-7細胞、NIH3T3細胞及EFC細胞。分別經(jīng)過高爾基體特異性熒光染料BODIPY-TR及PI染色，經(jīng)過熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)BC023882-EGFP融合蛋白主要定位在以上幾種細胞的細胞核內(nèi)，BC023882-EGFP融合蛋白在胞漿也有較弱的彌散性分布，并且該融合蛋白少數(shù)情況下也單獨出現(xiàn)在細胞的胞漿；胞漿表達的BC023882-EGFP融合蛋白并不局限于細胞的高爾基體區(qū)域，僅僅在高爾基體上出現(xiàn)較弱的共聚表達。

7、 3.BC023882基因?qū)毎芷诘挠绊?我們構建了BC023882的全長表達質(zhì)粒，并且通過篩選獲得了穩(wěn)定表達基因BC023882的COS-7細胞。利用帶有EGFP標記的psUGI載體構建了兩個siRNA質(zhì)粒，將載體V1導入后，根據(jù)RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)能夠86％抑制BC023882+-COS7細胞中基因BC023882的表達。細胞生長曲線繪制及流式細胞儀觀察發(fā)現(xiàn)：抑制基因BC023882表達后，RNA干擾后細胞的較對照

8、組BC023882+-COS7細胞生長速度加快，并且細胞周期中GO+G1期細胞減少，S期和G2+M期細胞增多，細胞分裂過程受到促進；然而未能達到正常組COS-7細胞的增殖狀況。 結論 1.基因BC023882的mRNA較為特異性的限制表達于胚胎及發(fā)育早期的小鼠腦組織內(nèi)，在胚胎期胚體組織和生后早期的肝臟組織也有微弱的表達。并且基因BC023882的mRAN在腦區(qū)的定位分布也顯示了較大的區(qū)域特異性，原位雜交的陽性信號主要出現(xiàn)

9、在腦組織的皮層各個部位，此外還集中于下丘腦(如視前區(qū)核團)以及內(nèi)囊，胼胝體等處的神經(jīng)纖維，其他腦區(qū)少見陽性的出現(xiàn)。另外，基因BC023882的mRNA的表達也呈明顯的時間依賴模式，一過性地短暫出現(xiàn)在小鼠發(fā)育的胚胎期和生后早期，隨后迅速減弱并消失。 2.通過對BC023882-EGFP融合蛋白的亞細胞定位觀察，我們認為基因BC023882表達的蛋白質(zhì)可能是一種核蛋白；它并不定位在細胞的高爾基體上，因此不屬于Golgin蛋白家族的成

10、員。 3.通過基因BC023882的細胞轉染和RNA干擾實驗的結果，我們認為基因BC023882能夠抑制COS-7細胞的有絲分裂，減慢細胞的增殖速度；而抑制轉染后的細胞內(nèi)基因BC023882表達則能夠使得這種細胞周期阻滯現(xiàn)象得到一定程度的緩解，部分恢復轉染前正常COS-7細胞的生長狀態(tài)。 假說：通過以上結論我們得到如下假說，即小鼠基因BC023882是一種發(fā)育早期中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性表達的基因；基因BC023882在一定程