耳甲區(qū)電針調(diào)節(jié)ZDF大鼠血漿褪黑素緩解神經(jīng)痛及降糖效應(yīng)的研究.pdf

1、褪黑素(Melatonin，MLT)又稱(chēng)為褪黑激素，在哺乳動(dòng)物中，一般認(rèn)為主要由松果體分泌，其分泌具有晝夜節(jié)律特點(diǎn)。從褪黑素被發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在已有近100年的時(shí)間。隨著研究的深入，人們對(duì)它作用的認(rèn)識(shí)愈加廣泛，除了與晝夜、季節(jié)、光照、生理周期、甚至生命周期相關(guān)的一些生理反應(yīng)與生理功能外，褪黑素還在緩解疼痛、調(diào)節(jié)血糖、減肥、抗抑郁等方面被深入地探究，且研究者對(duì)褪黑素的研究熱情經(jīng)久不衰。
　　 相對(duì)于人類(lèi)對(duì)于褪黑素近百年的研究，中國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)

2、學(xué)理論可以被追溯至兩千年前，而針刺療法則更加久遠(yuǎn)。在中醫(yī)理論形成后，針刺的作用機(jī)制被概括為“調(diào)和陰陽(yáng)”，而究竟如何“調(diào)和”，傳統(tǒng)理論并未給出一個(gè)令人信服的答案，而“陰、陽(yáng)”二字的由來(lái)確是因?yàn)楣湃藢?duì)光的觀察，繼而推演到對(duì)自然界晝夜、季節(jié)的更替闡釋并聯(lián)系到人自身的生理、病理。褪黑素作為一種跟光調(diào)節(jié)密切聯(lián)系的生物信號(hào)載體，并可以產(chǎn)生廣泛作用的激素，成為聯(lián)系自然光照變化節(jié)律與人體生物節(jié)律的一個(gè)紐帶。針刺的一些適應(yīng)病癥也恰與褪黑素缺乏類(lèi)的病癥相重

3、合，這不由的讓我們大膽聯(lián)想，調(diào)節(jié)褪黑素分泌可能是產(chǎn)生針刺復(fù)合效應(yīng)的機(jī)制之一。
　　 我們前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，耳甲區(qū)存在迷走神經(jīng)耳支傳人纖維的分布，恰當(dāng)?shù)碾姶碳つ軌虍a(chǎn)生迷走神經(jīng)刺激的效果(VNS)，繼而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)血糖、抗癲癇、抗抑郁、抗炎、降血壓等功效，并觀察到刺激耳甲區(qū)所產(chǎn)生的中樞神經(jīng)核團(tuán)的放電及神經(jīng)遞質(zhì)和相關(guān)蛋白的改變。另外，文獻(xiàn)記載了研究者對(duì)針刺療法和外源褪黑素協(xié)同作用的研究，認(rèn)為外源褪黑素與針刺效應(yīng)有相互促進(jìn)的作用。我們的

4、預(yù)實(shí)驗(yàn)重復(fù)了耳甲區(qū)電刺激對(duì)于病理模型大鼠鎮(zhèn)痛、降糖及抗抑郁效應(yīng)的觀察，發(fā)現(xiàn)耳甲區(qū)電刺激后，病理模型大鼠血漿褪黑素濃度的提高。這些線索讓我們聯(lián)想到，耳迷走神經(jīng)電刺激可以緩解病理疼痛模型大鼠的痛閾，降低糖尿病大鼠模型的血糖并促進(jìn)其胰島素分泌，緩解慢性應(yīng)激大鼠模型的抑郁癥狀，這些情形可能有褪黑素的參與，并且耳迷走神經(jīng)電刺激促進(jìn)了褪黑素的分泌，提高了血漿褪黑素的濃度，從而產(chǎn)生或者加強(qiáng)了上述效應(yīng)。
　　 本實(shí)驗(yàn)中，我們選用了Zucker

5、Diabetes Fat(ZDF)大鼠作為模型。這種模型大鼠具有(fa/fa)肥胖基因，并有遺傳性，在特殊飼料誘導(dǎo)下逐漸自發(fā)高血糖、高血脂、胰島素抵抗等2型糖尿病(T2DM)的典型癥狀，肥胖，并發(fā)感覺(jué)神經(jīng)痛等T2DM并發(fā)癥，在國(guó)際上廣泛用于T2DM及其并發(fā)癥以及肥胖、代謝類(lèi)疾病的研究，比傳統(tǒng)胰島β細(xì)胞損毀或部分損毀配合高脂飼料誘導(dǎo)的T2DM模型有著無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。這種模型在我們耳-迷走反射針刺效應(yīng)系列研究中的應(yīng)用尚屬首次，耳迷走神經(jīng)調(diào)節(jié)

6、褪黑素分泌來(lái)產(chǎn)生針刺效應(yīng)也是一個(gè)較新的研究思路。
　　 實(shí)驗(yàn)流程:
　　 1、耳甲區(qū)電針對(duì)ZDF大鼠體重、攝食的影響
　　 1.1動(dòng)物分組
　　 實(shí)驗(yàn)采用雄性6-8周齡Zucker Diabetes Fat(ZDF)大鼠及Zucker Lean(ZL)。ZL大鼠予以普通顆粒大鼠維持飼料喂養(yǎng)，ZDF大鼠予以Purina#5008（粗蛋白23.5％、粗脂肪6.5％）顆粒料飼養(yǎng)以誘導(dǎo)T2DM。所有大鼠自由飲水，

7、維持8:00-20:00光照、20:00-8:00黑暗交替的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立動(dòng)物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)3天，實(shí)驗(yàn)室溫度22±1℃，濕度50±5％，每籠4-6只。
　　 分組情況如下:
　　 1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1.2.1體重與內(nèi)臟脂肪比
　　 1)體重
　　 同周齡ZL大鼠與ZDF大鼠在實(shí)驗(yàn)前相比較，ZL大鼠平均比ZDF大鼠體重輕9％左右(P＜0.05)。經(jīng)過(guò)30天電針干預(yù)后，ZL大鼠和ZDF大鼠分別與各

8、自的空白對(duì)照組相比，耳甲區(qū)電針組(EA-ACR)體重增長(zhǎng)較低， MLT腹腔注射組(MTL-ZDF)與N-ZDF組相比較也較輕(P＜0.05)，而耳緣電刺激組(EA-AE)與其空白對(duì)照組(Na(i)ve，N)相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。從趨勢(shì)上來(lái)看，ZL與ZDF對(duì)照組在體重增長(zhǎng)率上（k=(y-b）/x）有差異(P＜0.05)，N-ZDF體重增長(zhǎng)較N-ZL組要快，N-ZDF與N-ZL末次體重測(cè)量有極顯著差異(P＜0.01)。
　

9、　 1.2.2攝食量
　　 與N-ZL組相比，ZDF組30日均攝食量顯著較大(P＜0.01)，而在ZL組的電針干預(yù)的兩組組(EA-AE，EA-ACR)其攝食量較低(P＞0.05)，但這兩組間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);與N-ZDF組比較，MLT-ZDF組30日均攝食量較低(P＜0.05)，而ZDF電針干預(yù)的兩組(EA-AE-ZDF, EA-ACR-ZDF)與N-ZDF之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 2、

10、耳甲區(qū)電針對(duì)ZDF大鼠疼痛行為的影響
　　 2.1動(dòng)物分組
　　 2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 2.2.1機(jī)械痛閾
　　 在手術(shù)前，各組比較均無(wú)顯著差異(P＞0.05);手術(shù)及電針刺激30天后，與N-ZL組相比，ZDF大鼠各組機(jī)械刺激收爪時(shí)間顯著下降(P＜0.01)，與N-ZDF相比，C-ZDF組收抓時(shí)間更低(P＜0.05);而ZDF耳甲區(qū)電刺激(EA-ACR-C-ZDF)與MLT干預(yù)組(MLT-C-ZDF)較N

11、-ZD和C-ZDF組高(P＞0.05)。從各組變化趨勢(shì)上來(lái)看，N-ZL組前后變化無(wú)顯著差異(P＞0.05)，N-ZDF組30天后較之前相比顯著降低(P＜0.01)，ZDF的3個(gè)CCI手術(shù)組在術(shù)后機(jī)械刺激收爪時(shí)間顯著下降(P＜0.01)，EA-ACR-C-ZDF與MLT-C-ZDF兩組干預(yù)后械刺激收爪時(shí)間有持續(xù)穩(wěn)定的回升，且高于N-ZDF組(P＜0.05)，MLT-C-ZDF組與EA-ACR-C-ZDF組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

12、
　　 2.2.2熱痛閾
　　 在手術(shù)前，各組比較均無(wú)顯著差異(P＞0.05);手術(shù)及電針刺激30天后，與N-ZL組相比，ZDF大鼠各組機(jī)械刺激收爪時(shí)間下降(P＜0.05; C-ZDF P＜0.01)，MLT-C-ZDF組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);與N-ZDF相比，C-ZDF組收抓時(shí)間較低(P＜0.05)，MTL-C-ZDF組較高(P＞0.05)，EA-ACR-C-ZDF組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);與C-ZDF組

13、相比，EA-ACR-C-ZDF組較高(P＜0.05)，MTL-C-ZDF組顯著升高(P＜0.01); MTL-C-ZDF組與EA-ACR-C-ZDF組比較，MTL-C-ZDF組較高(P＞0.05)。從各組變化趨勢(shì)上來(lái)看，N-ZL組前后變化無(wú)顯著差異(P＞0.05)，Z-ZDF組30天后較之前相比降低(P＜0.05)，ZDF的3個(gè)CCI手術(shù)組在術(shù)后機(jī)械刺激收爪時(shí)間下降(P＜0.05; C-ZDF, MLT-C-ZDF P＜0.01)，EA

14、-ACR-C-ZDF與MLT-C-ZDF兩組干預(yù)后械刺激收爪時(shí)間有所回升，MLT-C-ZDF組與C-ZDF組(P＜0.05)與EA-ACR-C-ZDF組(P＜0.01)相比回升較為顯著。
　　 3、耳甲區(qū)電針對(duì)ZDF大鼠血漿相關(guān)生化指標(biāo)的影響
　　 3.1動(dòng)物分組
　　 3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 3.2.1血糖
　　 實(shí)驗(yàn)前同周齡的ZDF大鼠與ZL大鼠相比血糖水平已有差異，ZDF大鼠血糖顯著高于ZL大

15、鼠血糖水平(P＜0.01);與ZDF空白對(duì)照組相比(N-ZDF)，ZDF其余三個(gè)干預(yù)組的血糖均有下降(P＜0.05)，且EA-ACR-ZDF組與MLT-ZDF組的血糖下降尤為顯著(P＜0.01); ZL各組間血糖比較未見(jiàn)明顯差異(P＞0.05);從前后變化趨勢(shì)上來(lái)看，ZL大鼠血糖較為平穩(wěn)，ZDF大鼠血糖實(shí)驗(yàn)前后比較均顯著增高(P＜0.01)，MLT-ZDF組在第2周時(shí)表現(xiàn)了較好的血糖控制作用(P＜0.05)，但在第4周時(shí)血糖有所回升，而

16、EA-ACR-ZDF與EA-AE-ZDF組在第3周和第4周時(shí)表現(xiàn)了較好的血糖控制作用(P＜0.05)。
　　 3.2.2褪黑素
　　 實(shí)驗(yàn)后各組大鼠血漿褪黑素水平與N-ZL組比較，ZDF各組均有顯著差異，ZDF組中N、EA-AE、M、C褪黑素水平顯著較低(P＜0.01)，EA-ACR、EA-ACR-C、M-C褪黑素較低(P＜0.05); ZL組中EA-ACR褪黑素較N組高(P＞0.05)，EA-AE組無(wú)顯著差異。ZDF組

17、中，與N-ZDF組比較，EA-ACR、EA-ACR-C、M-C組褪黑素水平升高(P＜0.05)，C組褪黑素水平下降(P＜0.05)。ZDF組中，EA-ACR與EA-AE、M組比較褪黑素水平較高(P＜0.05); EA-ACR-C、M-C組較C組顯著較高(P＜0.01)。ZL組中，N與EA-AE組無(wú)顯著差異(P＞0.05); ZDF組中，N、AE-EA、M組之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)，EA-ACR-C與M-C之間無(wú)顯著差異(P＞0.0

18、5)。
　　 3.2.3糖化血紅蛋白(Glycosylated hemoglobin，Gh)
　　 實(shí)驗(yàn)后各組間大鼠血漿糖化血紅蛋白水平，與N-ZL組比較，ZDF組中N、EA-AE、M組糖化血紅蛋白血漿濃度較高(P＜0.05)，其中ZDF中N、EA-AE顯著較高(P＜0.01)，ZL組中EA-AE、EA-ACR組無(wú)顯著差異，EA-ACR-ZDF組亦無(wú)顯著差異;EA-ACR-ZDF組與N-ZDF、EA-AE-ZDF比較顯著

19、較低(P＜0.01)，與M-ZDF比較較高(P＜0.05)。
　　 3.2.4胰島素
　　 實(shí)驗(yàn)后大鼠各組血漿胰島素水平變化，與N-ZL相比，EA-ACR-ZL組、N-ZDF組、EA-ZCR-ZDF組、M-ZDF組較高(P＜0.05)，其中EA-ACR干預(yù)的兩組血漿胰島素水平顯著較高(P＜0.01);ZL組中，EA-ACR干預(yù)組血漿胰島素水平較EA-AE組顯著增高(P＜0.01); ZDF組中，EA-ACR干預(yù)組較其余各

20、組均顯著增高(P＜0.01);而N-ZL與EA-AE組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，N-ZDF組、EA-AE組、M-ZDF組之間亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 3.2.5五羥色胺(5-HT)
　　 實(shí)驗(yàn)后各組血漿5-HT水平，與N-ZL、N-ZDF、C-ZDF組相比，EA-ACR-C-ZDF組(P＜0.01)與M-C-ZDF組(P＜0.05)顯著升高;EA-ACR-C-ZDF與M-C-ZDF組相比較高(P＜0

21、.05); N-ZL、N-ZDF、C-ZDF之間沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。
　　 4、電針刺激對(duì)ZDF大鼠中樞相關(guān)受體表達(dá)的影響
　　 4.1動(dòng)物分組
　　 同“3.1動(dòng)物分組”。
　　 4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 4.2.1免疫熒光
　　 從圖11、12中可以觀察到，N-ZL、EA-ACR-ZL、EA-ACR-ZDF、M-ZDF組mt1受體與INSRβ受體在下丘腦部共同表達(dá);EA-AE-Z

22、L、EA-AE-ZDF組僅見(jiàn)mt1受體表達(dá);N-ZDF組未見(jiàn)mt1受體與INSRβ受體表達(dá)。N-ZL、EA-ACR-C-ZDF、M-C-ZDF組mt1受體與5-HT1AR受體在脊髓腰膨大共同表達(dá);N-ZDF組與C-ZDF組未見(jiàn)mt1受體與5-HT1AR受體表達(dá)。
　　 4.2.1 Western blot
　　 mt1在下丘腦部的表達(dá)水平，與N-ZL相比，N-ZDF組較低(P＜0.05)，EA-ACR-ZL組，EA-AE

23、-ZDF組，EA-ACR-ZDF組，M-ZDF組顯著升高;與Z-ZDF相比，EA-ACR-ZL組，EA-AE-ZDF組，EA-ACR-ZDF組，M-ZDF組升高(P＜0.05)，其中EA-ACR-ZL組顯著提高(P＜0.01)，ZL組中EA-ACR組比EA-AE組亦有顯著提高;而N-ZL組與EA-AE-ZL組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ZDF干預(yù)組之間亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。mt1在脊髓腰膨大部的表達(dá)水平，與N-ZL相比EA-ACR-C-ZDF(P＜0.01

24、)顯著提高，N-ZDF與C-ZDF表達(dá)降低(P＜0.05);與N-ZDF相比，EA-ACR-C-ZDF顯著提高(P＜0.01)，N-ZDF與C-ZDF表達(dá)降低(P＜0.05);與M-C-ZDF相比，EA-ACR-C-ZDF亦有顯著提高(P＜0.01)。
　　 INSRβ在下丘腦處的表達(dá)水平，與N-ZL和N-ZDF相比，EA-ACR-ZL，EA-ACR-ZDF，M-ZDF組顯著提高(P＜0.05)，而EA-ACR與EA-AE組相比

25、亦分別有顯著提高。
　　 5-HT1AR在脊髓腰膨大部的表達(dá)水平，N-ZL水平與其他組相比有較高表達(dá)(P＜0.05);與C-ZDF和N-ZDF組相比EA-ACR-C-ZDF和M-C-ZDF組較高(P＜0.05)。
　　 5、結(jié)論
　　 本研究基于前期大量的臨床及基礎(chǔ)研究，從耳甲區(qū)-迷走神經(jīng)聯(lián)系學(xué)說(shuō)人手，提出耳甲區(qū)電刺激促進(jìn)褪黑素分泌，繼而產(chǎn)生緩解慢性神經(jīng)痛、調(diào)節(jié)血糖、降低體重等褪黑素缺乏類(lèi)相關(guān)疾病的假說(shuō)，并采用了

26、Zucker Diabetes Fat(ZDF)大鼠(fa/fa)基因突變模型，進(jìn)行了從行為學(xué)到生物化學(xué)到分子生物學(xué)不同層面的系統(tǒng)研究。
　　 通過(guò)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)整理分析可以發(fā)現(xiàn)，耳甲區(qū)電針刺激(EA-ACR)，可以有效控制ZDF肥胖大鼠模型的體重，抑制高血糖，提高血漿胰島素水平，降低了血漿糖化血紅蛋白水平，提高胰島素受體INSRβ在下丘腦的表達(dá);且緩解了ZDF慢性神經(jīng)痛模型大鼠的機(jī)械刺激疼痛和熱刺激疼痛，提高了血漿五羥色胺水平(5-