藏藥巴朱中兩種化合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及作用機(jī)制研究.pdf

1、前期研究從喜馬拉雅紫茉莉(Mirabilis himalaica)根部乙酸乙酯萃取部位分離得到化合物(E)-3-（4-羥基-2-甲氧基苯基）-苯烯酸-4-羥基-3-甲氧基苯酯(1)和Mirabij-alone E(2)?；衔?對人肝癌細(xì)胞HepG2表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒活性，其IC50值為15.12μg/mL。化合物2對人肺腺癌細(xì)胞A549表現(xiàn)出顯著細(xì)胞毒活性，其IC50值為10.97μg/mL。本文將分別開展化合物1對HepG2細(xì)胞、化

2、合物2對A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)及作用機(jī)制研究，內(nèi)容如下:
　　1、利用Brdu免疫熒光及soft agar軟瓊脂實(shí)驗(yàn)檢測化合物1對HepG2細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，20μg/mL的化合物1作用細(xì)胞48h后，與DMSO處理的對照組相比，能下調(diào)35.9％的Brdu陽性細(xì)胞數(shù)。此外，化合物1對克隆形成也有一定影響，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組的克隆數(shù)目減少約37.0％，克隆形狀也明顯變小。PI染色對細(xì)胞周期的檢測顯示化合物1阻滯HepG2細(xì)胞

3、于S期。與對照組相比，20μg/mL的化合物1能引起S期細(xì)胞比例從18.9％上升至36.0％，G1期細(xì)胞比例從70.8％下降至52.6％。細(xì)胞周期的內(nèi)源性調(diào)控主要是通過Cyclin-CDK-CDI的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控來實(shí)現(xiàn)。Western blot分析顯示，化合物1能上調(diào)cyclin D1、cyclinA、CDK4、CDK6和CDK2的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖。本課題前期研究顯示化合物1能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性

4、最高的基因，50％以上的惡性腫瘤中出現(xiàn)該基因的突變。在HepG2細(xì)胞中，p53基因?yàn)橐吧?，是一種抑癌基因。因此，我們檢測了化合物1對p53的影響。Western blot結(jié)果顯示化合物1能上調(diào)p53及其下游基因p21的表達(dá)。已有研究報(bào)道，p53通過Bax/Bcl-2，F(xiàn)as/Apol，IGF-BP3等蛋白，可完成對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。Bcl-2可阻止凋亡形成因子如細(xì)胞色素C等從線粒體釋放出來，具有抗凋亡作用，而Bax可與線粒體上的電壓

5、依賴性離子通道相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，具有促凋亡作用。Western blot分析發(fā)現(xiàn)，化合物1可以上調(diào)Bax的表達(dá)水平，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)?；衔?作用HepG2細(xì)胞后，Caspase-3被激活，產(chǎn)生有活性的兩個(gè)亞基，其分子量大小分別為17KDa和12KDa，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)Bcl-2蛋白后，化合物1不能再次引起顯著的細(xì)胞凋亡效應(yīng)，提示化合物1可能激活了內(nèi)源性通路從而

6、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究表明，通過轉(zhuǎn)染特異性的shRNA于HepG2細(xì)胞使其干涉p53基因表達(dá)后，當(dāng)化合物1作用p53si HepG2細(xì)胞時(shí)，與對照組GFPsi HepG2細(xì)胞中引起的68.8％凋亡相比，p53的干涉顯著降低了化合物1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其凋亡細(xì)胞數(shù)僅有20.6％。以上研究顯示，化合物1通過p53依賴方式激活內(nèi)源性線粒體通路從而引起細(xì)胞凋亡。此外，在裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中，通過皮下注射HepG2細(xì)胞從而成功接種移植瘤。數(shù)據(jù)顯示，化合

7、物1能夠在體內(nèi)抑制腫瘤的生長，與空白對照組相比，其瘤子體積和重量明顯變小。同時(shí)，各組裸鼠生長狀況良好，給藥組裸鼠體重與空白對照組沒有顯著性差異，提示化合物1在該給藥過程中未對裸鼠的正常生長產(chǎn)生不良反應(yīng)。
　　2、利用Brdu免疫熒光及soft agar軟瓊脂實(shí)驗(yàn)檢測化合物2對A549細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，20μg/mL的化合物2作用細(xì)胞48h后，與DMSO處理的對照組相比，能下調(diào)62.2％的Brdu陽性細(xì)胞數(shù)。此外，化合物2對

8、克隆形成也有一定影響，實(shí)驗(yàn)組的克隆數(shù)目相比對照組減少約73.9％，克隆形狀也明顯變小。PI染色對細(xì)胞周期的檢測顯示，對照組及20μg/mL和40μ g/mL的化合物2引起的S期細(xì)胞比例分別為18.37％，34.13％和48.74％，呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。以上結(jié)果表明，化合物2通過阻滯A549細(xì)胞于S期，進(jìn)而影響其細(xì)胞增殖。AnnexinV/FITC染色的流式細(xì)胞分析表明化合物2誘導(dǎo)了A549細(xì)胞凋亡的發(fā)生。當(dāng)化合物2濃度為20μg/mL和4

9、0μg/mL時(shí)，分別引起了31.7％和48.0％的細(xì)胞凋亡，與對照組相比具有顯著性差異。Western blot檢測表明，化合物2對Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bax有上調(diào)作用，同時(shí)能下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2?；衔?作用A549細(xì)胞后，Caspase-3被激活，產(chǎn)生有活性的兩個(gè)亞基，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。以上研究顯示，化合物2可能通過激活線粒體通路誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，其深入作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。此外，化合物2在體內(nèi)裸鼠移植瘤模型中，以濃度依