蓮藕NnDREB2A克隆、表達分析和功能驗證.pdf

1、蓮藕（Nelumbo nucifera Gaertn.）是睡蓮科蓮屬多年生水生草本植物，原產(chǎn)中國和印度，是我國栽培面積最大的水生蔬菜。蓮藕產(chǎn)品藕、蓮子等具有很好的營養(yǎng)、保健功能，深受消費者歡迎。近年來，設施土壤次生鹽漬化及鹽堿化土壤面積逐年增加，影響土壤的高效利用。DREB(Dehydration Responsive Element Binding Protein)是植物逆境脅迫響應因子，通過激活與耐（抗）鹽相關(guān)基因的表達，提高植物的

2、耐（抗）鹽性。本研究在蓮藕資源耐鹽性評價基礎(chǔ)上，在耐鹽蓮藕資源中克隆DREB，并對該基因表達特征及功能進行分析。
　　1、蓮藕資源耐鹽性評價利用0.6％ NaCl溶液處理7份蓮藕資源，蓮藕資源的鹽害指數(shù)、葉綠素含量、丙二醛含量、抗氧化酶活性及根系活力等差異較大，其中H8葉片細胞膜透性最低，而H5受鹽害后根系活力最高和葉片鹽害指數(shù)最低，并與其他資源差異顯著。采用加權(quán)隸屬函數(shù)法綜合評價蓮藕資源耐鹽性強弱依次為:H5＞H8＞E2＞E4＞

3、E1＞E3＞H2。
　　2、蓮藕NnDREB2A基因克隆與分析采用PCR-RACE技術(shù)，克隆得到蓮藕H5 DREB基因全長為1146 bp的cDNA序列，包含63 bp的5′端非編碼區(qū)、162 bp的3′端非編碼區(qū)和921 bp的完整開放閱讀框，編碼306個氨基酸，該蛋白質(zhì)分子量為34.75 kD，等電點為5.70。蓮藕DREB2基因組DNA全長1548 bp，含2個外顯子和1個內(nèi)含子。該基因核苷酸序列與蓮藕(sacred lot

4、us)DREB2A（XM_010255824.1）、擬南芥DREB2A(NM_120623.2)、馬鈴薯DREB2A(XM_006353357.1)的相似性分別為96％、78％、73％。暫命名該基因為NnDREB2A。
　　3、蓮藕NnDREB2A的表達分析利用半定量RT—PCR技術(shù)，以β-actin為內(nèi)參，研究了NnDREB2A的表達特性，結(jié)果表明:經(jīng)0.6％ NaCl溶液處理后，NnDREB2A在葉、葉柄、地下莖和頂芽中表達量

5、均增加;處理后3h，地下莖和頂芽中表達量達最高，處理后18h在葉柄和葉片表達量最高;100μmol/L ABA處理后12h，項芽中表達量最高;4℃低溫和300mM甘露醇處理不能誘導NnDREB2A在頂芽中表達。
　　4、蓮藕NnDREB2A功能的初步驗證成功構(gòu)建NnDREB2A表達載體pSN1301-NnDREB2A。浸染擬南芥花蕾，得到PC43、PC44、PC48三個轉(zhuǎn)基因陽性株系。對轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥進行鹽、干旱、低溫

6、和淹水脅迫處理后發(fā)現(xiàn)，在含200 mM NaCl的MS培養(yǎng)基上，PC43、PC44、PC48萌發(fā)率分別72％、72％、60％，而野生型擬南芥的萌發(fā)率為20％; PC43、PC44和PC48播種在含有100 mM NaCl的培養(yǎng)基上，20 d后平均根長分別為4.64、6.54和6.01 cm，而野生型植株平均根長為3.88 cm;利用250 mM NaCl溶液處理轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥幼苗，10d后發(fā)現(xiàn)PC43、PC44、PC45存活率分別

7、為57％、39％和62％，野生型植株存活率僅為12％。上述結(jié)果表明轉(zhuǎn)入NnDREB2A后提高了擬南芥的耐鹽能力。在含300 mM甘露醇的MS培養(yǎng)基上，野生型植株根長明顯長于轉(zhuǎn)基因植株;同時干旱處理2周后，野生型植株的存活率比轉(zhuǎn)基因擬南芥高2.7倍，表明轉(zhuǎn)入NnDREB2A后降低了植株的耐干旱脅迫能力。-20℃處理15h和淹水處理5d后，野生型擬南芥存活率比轉(zhuǎn)基因擬南芥分別高1.9和13.7倍，表明轉(zhuǎn)NnDREB2A降低了植株的耐低溫和耐