桃EST-SSR引物開(kāi)發(fā)及其在部分薔薇科物種中的通用性研究.pdf

1、桃是世界上重要的經(jīng)濟(jì)果樹(shù)和園林樹(shù)種，同時(shí)也是薔薇科木本模式植物，研究桃的種質(zhì)資源和遺傳背景具有重大意義。在當(dāng)前，SSR標(biāo)記仍然是研究植物物種種質(zhì)資源和遺傳背景的重要手段之一。然而，桃的可用SSR引物數(shù)量稀少，薔薇科其他物種的SSR引物數(shù)量更是寥寥無(wú)幾。2013年，Verde等人基于桃的不同器官進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，匯總先前的研究后共提交到NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)有80797條無(wú)冗余ESTs序列，為桃EST-SSR引物的大規(guī)模開(kāi)發(fā)提供了豐富的序列資

2、源。本研究先利用MISA軟件對(duì)來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的80797條EST序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)挖掘，然后利用primer3模塊批量設(shè)計(jì)SSR引物，最后，采用PCR技術(shù)在12個(gè)不同類(lèi)型的桃品種上分組隨機(jī)驗(yàn)證了100對(duì)二核苷酸重復(fù)引物，在30個(gè)常見(jiàn)薔薇科物種上分組隨機(jī)調(diào)查了48對(duì)桃EST-SSR引物的通用性。主要研究結(jié)論如下:
　　(1)EST-SSR位點(diǎn)挖掘
　　利用CD hit軟件對(duì)80797條無(wú)冗余EST序列的冗余率進(jìn)行復(fù)查，發(fā)現(xiàn)

3、冗余率仍有12.3％。用MISA軟件對(duì)剩余70360條EST序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)挖掘，發(fā)現(xiàn)有12519個(gè)SSR位點(diǎn)分布于10272條ESTs序列中，SSR位點(diǎn)出現(xiàn)頻率為14.60％。SSR類(lèi)型覆蓋二核苷酸重復(fù)到六核苷酸重復(fù)的159種基序類(lèi)型。其中，以單核苷酸重復(fù)、二核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)類(lèi)型最多，分別占35.80％、36.43％和25.56％。此外，SSR基序重復(fù)次數(shù)越多，SSR位點(diǎn)分布頻率越低。在基序長(zhǎng)度相同的SSRs中，不同基序組成

4、分布不均勻，并且對(duì)少數(shù)基序組成有偏好。
　　(2)SSR引物設(shè)計(jì)
　　利用primer3模塊對(duì)12519條EST-SSR設(shè)計(jì)引物，得到4526對(duì)SSR引物，其中，常用的二核苷酸引物和三核苷酸引物合計(jì)有2598對(duì)。引物開(kāi)發(fā)效率只取決于EST-SSR基數(shù)的大小，引物開(kāi)發(fā)總效率為36.15％。
　　(3)SSR-PCR驗(yàn)證
　　分段抽選的100對(duì)SSR引物在12個(gè)不同類(lèi)型的桃品種上擴(kuò)增出237個(gè)條帶，平均2.37個(gè);7

5、9％的引物能夠擴(kuò)增出2個(gè)或2個(gè)以上的條帶。期望雜合度變幅為0-0.7659，平均0.3817;觀(guān)察雜合度變幅為0-0.9167，平均0.1230;引物鑒別力變幅為0-0.8056，平均0.4054。
　　(4)通用性研究
　　通用性分析表明:66.67％的SSR引物能夠在30個(gè)薔薇科物種上全部有效擴(kuò)增，33.33％的SSR引物能夠在30個(gè)薔薇科物種中部分有效擴(kuò)增。其中，引物018在16個(gè)物種上有缺失，是缺失率最高的引物;物種