6-羥基多巴胺致偏側(cè)帕金森病大鼠的CatWalk行為學(xué)研究.pdf

1、研究背景:
　　 帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)是一種常見于中老年人群的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為肢體靜止性震顫、運(yùn)動遲緩和肌僵直三大運(yùn)動癥狀。由于PD病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，尚無根本性的治療方法。目前，所有臨床治療技術(shù)以控制癥狀、改善運(yùn)動功能、延緩致殘時間為目的。以左旋多巴(L-DOPA)為代表的內(nèi)科藥物治療可改善PD早期運(yùn)動癥狀，但隨著病程進(jìn)展，藥物耐受情況日漸明顯，異動癥、開關(guān)現(xiàn)象等晚期

2、并發(fā)癥相繼出現(xiàn)，因此需要新的干預(yù)手段。深部腦刺激術(shù)(deepbrainstimulation，DBS)，是通過立體定向手術(shù)，將刺激電極植入病人特定深部腦神經(jīng)核團(tuán)，對核團(tuán)進(jìn)行慢性刺激，調(diào)節(jié)引起癥狀的異常電活動，從而消除或改善患者癥狀，以達(dá)到臨床治療目的。高頻電刺激丘腦底核(Subthalamicnucleus，STN)可改善晚期PD的大多數(shù)運(yùn)動癥狀，并且具有可控、可逆、微創(chuàng)等較傳統(tǒng)外科手術(shù)的明顯優(yōu)勢，使其成為晚期PD的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。但是高

3、頻電刺激丘腦底核并不能改善PD的所有癥狀，尤其是對晚期PD的步態(tài)紊亂、平衡障礙等軸性癥狀療效欠佳，后者是導(dǎo)致PD患者摔倒的高危因素，引起患者股骨頸骨折、腦卒中等一系嚴(yán)重并發(fā)癥。因此，探索對晚期PD軸性癥狀具有治療作用的新靶點是DBS研究的熱點問題。
　　 腳橋核(Pedunculopontinenucleus，PPN)是位于中腦、橋腦交界處的神經(jīng)元核團(tuán)，是中樞運(yùn)動中樞的重要組成部分。研究提示電刺激PPN可有效改善晚期PD的運(yùn)動癥

4、狀，尤其對丘腦底核電刺激無效的姿勢不穩(wěn)、步態(tài)障礙等為主的軸性癥狀有明顯療效。低頻刺激腳橋核可改善晚期PD的軸性癥狀，但動物實驗的研究結(jié)果間存在較大差異，甚至出現(xiàn)矛盾，究其原因可能在于目前尚缺乏統(tǒng)一的量化行為學(xué)指標(biāo)，尤其是步態(tài)方面的量化研究。為此，本研究采用CatWalk自動步態(tài)分析系統(tǒng)檢測6-羥基多巴胺(6-OHDA)致PD模型大鼠的不同時期的步態(tài)變化，并對其進(jìn)行量化分析，探討量化研究PD步態(tài)變化的可靠的行為學(xué)指標(biāo)。
　　 目的

5、:
　　 1.建立基于CatWalk自動步態(tài)分析系統(tǒng)分析正常大鼠步態(tài)的分析方法;
　　 2;研究偏側(cè)帕金森病模型大鼠在CatWalk自動步態(tài)分析系統(tǒng)中的步態(tài)特點，探討最佳的參數(shù)特征。
　　 方法:
　　 1.正常大鼠的CatWalk行為學(xué)研究采用6只正常近交系雄性SPF級Wistar大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢查無明顯異常后，實施CatWalk行為學(xué)檢查及圓柱實驗(Cylindertest，又稱前肢不對稱實驗)。每只

6、大鼠接受前期訓(xùn)練（該期間的數(shù)據(jù)不進(jìn)行統(tǒng)計分析），采集基線值，其主要目的是:在盡可能減少食物引誘之外的其他干擾因素的情況下，使大鼠可以順利通過CatWalk玻璃板，即在8s內(nèi)不停頓、不回頭地通過CatWalk玻璃板。CatWalk步態(tài)分析系統(tǒng)主要由含內(nèi)置熒光燈的玻璃板、玻璃下方的高頻攝像頭及圖像傳輸轉(zhuǎn)換系統(tǒng)、計算機(jī)等硬件設(shè)施和自帶軟件組成。CatWalk步態(tài)采集，試驗過程為:大鼠至少記錄3次順暢通過玻璃板，而且每次記錄通過至少有10步。當(dāng)

7、大鼠順利通過CatWalk時，大鼠爪印會因玻璃內(nèi)的熒光燈發(fā)出的熒光發(fā)生反射，被下方的攝像頭捕捉，從而傳輸?shù)接嬎銠C(jī)，記錄下來，然后進(jìn)行離線或在線處理、分析。CatWalk系統(tǒng)根據(jù)每個爪印的位置、大小、壓強(qiáng)及不同時間點爪印之間的相互關(guān)系，計算出步態(tài)的定量及定性參數(shù)，從而計算出步態(tài)的靜態(tài)及動態(tài)指標(biāo)。本實驗關(guān)注CatWalk原始的、定量性爪印指標(biāo)，包括:站立時間（s，站立期內(nèi)爪印與玻璃板接觸的時間），站立指數(shù)（衡量肢體離開玻璃板的速度），最大接

8、觸面積（cm2，爪印與玻璃板的最大接觸面積），爪印長度（cm，爪印在水平方向上的距離），爪印寬度（cm，爪印在垂直方向上的距離），爪印面積(cm2，爪印與玻璃板接觸的表面積)，最大壓強(qiáng)（a.u.，爪印與玻璃板完全接觸時的最大壓強(qiáng)），最小壓強(qiáng)(a.u.，爪印與玻璃板完全接觸時的最小壓強(qiáng))，平均壓強(qiáng)（a.u.，爪印與玻璃板完全接觸時的平均壓強(qiáng)），最大接觸時最大壓強(qiáng)(a.u.)，最大接觸時平均壓強(qiáng)(a.u.)，懸空時間（s，爪印離開玻璃板的時

9、間），懸空時速度(cm/s，爪印處于懸空期的速度)，行走循環(huán)（s，站立期與懸空期時間總和）等。
　　 2.偏側(cè)PD大鼠的CatWalk行為學(xué)研究采用18只正常近交系雄性SPF級Wistar大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢查無明顯異常，隨機(jī)分為6-OHDA損傷組(n=12)、假手術(shù)組(n=6)，采用立體定向手術(shù)將6-OHDA溶液和等量生理鹽水注入假手術(shù)組和6-OHDA組大鼠的左側(cè)內(nèi)側(cè)縱束(MLF)。術(shù)前1周訓(xùn)練大鼠并CatWalk系統(tǒng)中采集行為學(xué)

10、數(shù)據(jù)基線值，術(shù)后3d、1周、2周，依次進(jìn)行圓柱實驗，再將大鼠置于Catwalk自動步態(tài)分析儀中，記錄其步態(tài)變化，離線分析相關(guān)數(shù)據(jù)。CatWalk實驗方法同前。然后取所有6-OHDA組大鼠、假手術(shù)組大鼠2只進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的凋亡情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.正常大鼠的圓柱實驗結(jié)果提示，左、右前肢差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且不隨時間變化（P＞0.05）。CatWalk自動步態(tài)分析系統(tǒng)的分析參數(shù)包

11、括:爪印分析、步序分析(StepSequence)、BOS(BaseofSupport)、爪印位置(PrintPosition)支持力(Support)、時相分布(PhaseDispersions)和聯(lián)結(jié)(Couplings)。爪印分析中有定性、定量分析;步序有6種，Wistar大鼠以AB為主;BOS分為前肢與后肢;爪印位置分為左肢與右肢;時相分布有對角線（右前肢-左后肢，左前肢-右后肢）、共側(cè)（左后肢-右后肢、左前肢-右前肢）和同側(cè)（

12、右前肢-右后肢、作前肢-左后肢）;聯(lián)結(jié)有對角線（右前肢-左后肢、左前肢-右后肢、右后肢-左前肢）、共側(cè)（左后肢-右后肢、左前肢-右前肢、右后肢、左后肢）和同側(cè)（右前肢-右后肢、左前肢-左后肢、左后肢-左前肢）。
　　 2.偏側(cè)PD大鼠的CatWalk行為學(xué)特征，圓柱實驗顯示:立體定向術(shù)后，6-OHDA組大鼠的左、右前肢對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），假手術(shù)組大鼠左、右前肢對比差異無顯著性意義（P＞0.05）。CatWalk

13、分析顯示:假手術(shù)組大鼠手術(shù)后左、右肢體對比，各肢體的術(shù)前、術(shù)后對比中各指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。6-OHDA組大鼠手術(shù)后，左、右肢體對比中，雙前肢的最大接觸面積、爪印長度、爪印寬度和爪印面積以及雙后肢的最大接觸面積之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);6-OHDA組大鼠各肢體的術(shù)前、術(shù)后對比中，右后肢的四項下降，左前肢的爪印長度、爪印寬度和爪印面積下降，右前肢的最大接觸面積、爪印長度和爪印面積下降，四項參數(shù)在左后肢中

14、僅爪印寬度下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 結(jié)論及討論:
　　 1.CatWalk自動步態(tài)分析系統(tǒng)可以從多方面、定性、定量的對正常大鼠的步態(tài)進(jìn)行分析。
　　 2.并非所有參數(shù)都是反映PD步態(tài)的合適指標(biāo)，結(jié)合偏側(cè)PD大鼠模型的特點，CatWalk參數(shù)除在假手術(shù)組中要保持穩(wěn)定性，還應(yīng)符合以下要求:A.PD模型成功后，左、右肢體對比有差異，這與經(jīng)典的圓柱實驗原理類似;B.PD模型術(shù)前、術(shù)后比較中有差異，而

15、且不同側(cè)、不同肢體間的情況不同，即該參數(shù)在毀損對側(cè)有差異，且同側(cè)無差異，并且在毀損對側(cè)的前肢、后肢都有差異，這樣就能具有更好的敏感性與特異性，從而很好地從行為學(xué)上定量反應(yīng)PD模型中黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元死亡情況。結(jié)合本研究結(jié)果，只有最大接觸面積符合要求，也就是說從制動期到推進(jìn)期轉(zhuǎn)折點時爪印與玻璃板的接觸面積。爪印長度、爪印寬度和爪印面積雖然在術(shù)后2周左、右前側(cè)肢體對比中有顯著差異，符合要求A，與經(jīng)典的圓柱實驗結(jié)果一致。爪印長度與爪印

16、面積雖然在毀損對側(cè)的前、后肢體上均存在差異，似乎部分符合要求B，但是這2項參數(shù)在毀損同側(cè)前肢也存在差異，所以不作為首選指標(biāo)。爪印寬度在毀損對側(cè)前肢有差異，但不能完全反應(yīng)對側(cè)后肢的運(yùn)動情況;另外，爪印寬度在毀損同側(cè)前、后肢體均存在差異，不符合要求B。綜合CatWalk的各項參數(shù)，最大接觸面積同時符合上述提到的2項要求，這與PD患者在起步、轉(zhuǎn)身、有復(fù)雜思維活動時運(yùn)動癥狀加重有某種意義上的聯(lián)系，但具體機(jī)制尚不明確?？傊珻atWalk是一種檢