人肝細(xì)胞-乳鼠原位移植模型構(gòu)建中細(xì)胞免疫機(jī)制的研究.pdf

1、近年來(lái)通過(guò)異種肝細(xì)胞移植的手段，解決同種供體短缺的問(wèn)題已成為全球研究的熱點(diǎn)。雖然異種肝細(xì)胞移植在短期內(nèi)改善肝臟先天性酶缺陷和血液系統(tǒng)病變及急、慢性肝衰竭等方面的有效性已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械玫阶C實(shí)，但其后發(fā)生的免疫排斥問(wèn)題仍然成為阻礙異種肝細(xì)胞移植在臨床中得以廣泛應(yīng)用研究的最大難題。 目前，有關(guān)異種肝細(xì)胞移植的免疫排斥機(jī)制的研究主要存在以下幾個(gè)問(wèn)題：一、異種移植物會(huì)面臨來(lái)自受體更激烈，更迅速的免疫排斥，在幾小時(shí)內(nèi)就可能完全喪失功能或

2、壞死，因而有關(guān)異種細(xì)胞移植中免疫排斥的動(dòng)態(tài)研究不能很好地開展。二、相對(duì)于同種肝細(xì)胞移植，T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)免疫排斥在異種肝細(xì)胞移植過(guò)程中的作用尚存在爭(zhēng)議，有關(guān)異種肝細(xì)胞原位移植的免疫排斥機(jī)制鮮有報(bào)道。三、異種移植中的免疫排斥反應(yīng)常因移植物種類的不同，所帶抗原數(shù)量、強(qiáng)度以及受者的免疫功能狀態(tài)的差異，特別是具體到某一器官如肝臟，其免疫排斥反應(yīng)將各具其特殊性。 針對(duì)上述問(wèn)題，我們根據(jù)發(fā)育免疫學(xué)原理，對(duì)課題設(shè)計(jì)進(jìn)行了可行性分析：首先，肝臟在

3、移植領(lǐng)域被成為“免疫特惠器官”，長(zhǎng)期臨床研究發(fā)現(xiàn)肝臟移植后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率及嚴(yán)重程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它器官，具有獨(dú)特的耐受原性；同時(shí)，肝臟是甲胎蛋白的主要合成及分泌器官，甲胎蛋白是一種胚胎性腫瘤相關(guān)蛋白，免疫應(yīng)答中的AFP主要表現(xiàn)為免疫抑制的生物學(xué)特征，而小鼠出生后一段時(shí)間內(nèi)AFP在肝臟仍保持著較高水平的表達(dá)；因此，我們認(rèn)為該發(fā)育階段的肝臟免疫微環(huán)境具有適合異種移植的特殊性。另外，針對(duì)“外來(lái)細(xì)胞抗原所致免疫耐受”的現(xiàn)象，研究認(rèn)為免疫系統(tǒng)接

4、觸外來(lái)抗原所產(chǎn)生的免疫耐受程度與免疫系統(tǒng)發(fā)育未成熟有關(guān)。如果我們?cè)谑荏w免疫系統(tǒng)發(fā)育的早期給予異種抗原的移植，將會(huì)減緩受體的異種免疫排斥，或者直接形成耐受。綜上所述，我們選用新生小鼠肝臟作為移植受體，設(shè)想該發(fā)育階段的肝臟微環(huán)境會(huì)緩解或者推遲機(jī)體的免疫排斥的強(qiáng)度或速度，將有利于免疫排斥發(fā)生的動(dòng)態(tài)過(guò)程及其相關(guān)機(jī)制的研究。同時(shí)，鑒于主要組織相容性抗原為移植排斥反應(yīng)發(fā)生的主要移植抗原，它由種系基因構(gòu)成，代表了某個(gè)物種在進(jìn)化上的特異性。肝癌細(xì)胞不僅

5、具有與人類正常肝細(xì)胞相同的移植抗原，同時(shí)作為正常肝細(xì)胞的替代物在肝臟相關(guān)疾病的實(shí)驗(yàn)性治療中被證明有良好的效果。因此，本實(shí)驗(yàn)選用3株人肝癌細(xì)胞，1株人正常肝細(xì)胞及1株人肺癌細(xì)胞作為待選異種移植物，通過(guò)對(duì)比篩選合適的受-供體組合，力圖建立一種理想的人肝細(xì)胞-乳鼠異種原位移植模型，并系統(tǒng)地對(duì)移植過(guò)程中細(xì)胞免疫排斥的時(shí)程變化及其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究。 研究方法： 1、人肝細(xì)胞-乳鼠原位移植模型的探索性構(gòu)建 1）根據(jù)動(dòng)物模型構(gòu)

6、建方法，體外肝部直接注射進(jìn)行五種人相關(guān)細(xì)胞的原位移植； 2）活體熒光染料DiI標(biāo)記技術(shù)對(duì)移植的人細(xì)胞進(jìn)行受體內(nèi)的定位示蹤； 3）解剖觀察移植細(xì)胞在乳鼠肝內(nèi)的移植成功率及生長(zhǎng)狀況； 4）常規(guī)病理技術(shù)分析各組人細(xì)胞在乳鼠肝內(nèi)的免疫病理發(fā)展過(guò)程； 5）免疫組化檢測(cè)移植物在受體內(nèi)AFP及Suvivin蛋白的表達(dá)狀況。 2、乳鼠血清AFP表達(dá)特征與肝細(xì)胞移植微環(huán)境的關(guān)系 1）等數(shù)量級(jí)的人肝癌細(xì)胞He

7、pG2分別進(jìn)行乳鼠皮下及肝內(nèi)原位移植，成鼠原位移植不同數(shù)量級(jí)的HepG2細(xì)胞： 2）活體熒光染料DiI標(biāo)記技術(shù)對(duì)移植細(xì)胞進(jìn)行受體內(nèi)定位示蹤； 3）常規(guī)病理切片對(duì)比分析移植細(xì)胞在各移植部位免疫病理學(xué)過(guò)程； 4）定量ELISA檢測(cè)移植前后乳鼠血清AFP的動(dòng)態(tài)變化特征。 3、人肝細(xì)胞--乳鼠原位移植中細(xì)胞免疫排斥機(jī)制的研究 1）利用免疫調(diào)節(jié)劑（CsA，PolyI：C）分別設(shè)置免疫激活及免疫抑制兩個(gè)參照狀

8、態(tài)； 2）不同免疫狀態(tài)下人肝細(xì)胞-乳鼠原位移植模型的構(gòu)建； 3）不同免疫狀態(tài)下移植細(xì)胞免疫病理過(guò)程的變化； 4）NK細(xì)胞殺傷活性的檢測(cè)； 5）刀豆蛋白誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞活性的檢測(cè)； 6）流式分析T淋巴細(xì)胞亞群分布的變化； 7）定量ELISA檢測(cè)小鼠IL-2，IL-10血清水平的變化特征。 研究結(jié)果： 第一部分： 解剖觀察移植情況 肝癌細(xì)胞移植組均具有較高的移植

9、成功率，個(gè)案伴有一定程度的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。人肺癌細(xì)胞移植成功率較低，并伴有消退趨勢(shì)。人正常肝細(xì)胞移植組僅2個(gè)案例肝臟觀察到異常部位?；铙w熒光染料DiI的定位分析 熒光定位分析確定解剖觀察到的結(jié)節(jié)組織為移植或轉(zhuǎn)移的人細(xì)胞，各組肝癌細(xì)胞在肝內(nèi)占位明顯，熒光信號(hào)均勻穩(wěn)定；人肺癌細(xì)胞占位較?。蝗苏８渭?xì)胞組解剖觀察到的異常部位為熒光染料非特異性著色，無(wú)細(xì)胞性結(jié)構(gòu)。 常規(guī)病理切片分析 原位移植初期（0-5天），人肝癌細(xì)胞保持著良

10、好的腫瘤形態(tài)特征，8天前后移植區(qū)域逐漸出現(xiàn)淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，移植物的相繼壞死，發(fā)生肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的人肝癌細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)結(jié)束未出現(xiàn)淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)及壞死。原位移植的人肺癌細(xì)胞于移植后5天出現(xiàn)明顯的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及嚴(yán)重壞死。 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 原位移植及轉(zhuǎn)移的各組人癌細(xì)胞均保持著原有的蛋白表達(dá)特征：Bel7402與HepG2：AFP+； SK-Hep-1與A549：AFP-； Survivin全部陽(yáng)性表達(dá)。 第二部分： 人肝

11、癌細(xì)胞HepG2的乳鼠皮下移植 皮下移植物于移植第2天出現(xiàn)淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)及后續(xù)的嚴(yán)重壞死，并于移植后2周完全消退。 人肝癌細(xì)胞HepG2的成鼠肝內(nèi)移植 僅有10％的個(gè)案形成類似乳鼠原位移植的移植物結(jié)節(jié)，移植物于移植后24小時(shí)出現(xiàn)明顯的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，或被炎癥細(xì)胞包裹，人肝癌細(xì)胞空泡化繼而壞死，移植細(xì)胞數(shù)量級(jí)的增大，并未緩解免疫排斥反應(yīng)出現(xiàn)的強(qiáng)度與速度。 AFP血清濃度變化 正常昆明種小鼠：AFP血

12、清濃度出生后三天內(nèi)保持較高水平的表達(dá)，并于出生后兩周恢復(fù)至成體水平，痕量。 人肝癌細(xì)胞的移植引起乳鼠肝臟AFP的特異性再表達(dá)，于移植后的5-9天保持高水平的血清濃度，與正常小鼠有顯著差異。 人正常細(xì)胞與人肺癌細(xì)胞的移植，及成鼠肝內(nèi)的移植未引起血清水平的顯著變化。乳鼠皮下移植未引起AFP血清濃度的變化。 第三部分： 免疫調(diào)節(jié)劑的影響 CsA組：移植物占位偏大，形態(tài)不規(guī)則，移植細(xì)胞呈侵襲性生長(zhǎng)；于實(shí)

13、驗(yàn)第14天移植區(qū)域出現(xiàn)微弱的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，發(fā)展趨勢(shì)緩慢，移植后35d內(nèi)移植物未出現(xiàn)明顯壞死。 PolyI：C組：移植物占位明顯小于正常移植組，移植后第2天就出現(xiàn)明顯的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，并于移植后第5天出現(xiàn)大面積壞死。 NK細(xì)胞殺傷活性 移植組：移植后第4天NK細(xì)胞殺傷活性明顯升高，CsA組：NK細(xì)胞殺傷于移植后呈緩慢上升趨勢(shì)，總體水平低于移植組，PolyI：C組NK細(xì)胞殺傷活性一直保持較高水平，與其它兩組差異顯著

14、。 T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化活性 移植組：移植第7天T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性由緩慢上升轉(zhuǎn)為明顯升高，具有顯著性；CsA組與PolyI：C組的T細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性皆緩慢上升，無(wú)大幅度變化，PolyI：C組最高，CsA組最低。 T淋巴細(xì)胞亞群的分布 出生后小鼠T細(xì)胞分化尚未完善，CD4+，CD8+T細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間不斷增加。移植組CD4+與CD8+T細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)皆高于正常小鼠，CD4+T細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)較快，于移植后11天CD4

15、+/CD8+比值達(dá)到最高值，顯著高于其它組。CsA組CD4+T細(xì)胞百分含量位于各組最低，CD4+/CD8+比值出現(xiàn)紊亂直至逆轉(zhuǎn)。PolyI：C組CD4+與CD8+T細(xì)胞百分率增長(zhǎng)速率明顯高于其它組，CD4+/CD8+比值略高于正常小鼠。細(xì)胞因子IL-2，IL-10的表達(dá)特征 移植組小鼠于移植后第3天IL-2血清濃度降至最低，IL-10達(dá)到最高濃度，隨后逆轉(zhuǎn)，第7天IL-2濃度誘生至最高點(diǎn)，IL-10濃度降至最低點(diǎn)；CsA組IL-

16、2受到明顯的抑制，IL-10濃度較其它組最高；PolyI：C組IL-10濃度低于移植組，IL-2濃度顯著高于其它實(shí)驗(yàn)組。 研究結(jié)論： 1、首次對(duì)昆明種小鼠出生后血清甲胎蛋白的表達(dá)特征進(jìn)行了定量分析，與BALB/c/J， BALB/c/ BOM and C3H/He等種系小鼠具有相似的表達(dá)模式。 2、乳鼠肝臟內(nèi)AFP高水平的表達(dá)可保證異種移植物的存活，推遲T細(xì)胞誘導(dǎo)的異種移植免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。 3、針對(duì)異

17、種肝細(xì)胞移植中細(xì)胞免疫排斥反應(yīng)的動(dòng)態(tài)研究，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的人肝細(xì)胞-乳鼠異種原位移植模型是一種良好的研究平臺(tái)。 4、異種移植細(xì)胞免疫排斥過(guò)程中，NK細(xì)胞活性的誘發(fā)早于T細(xì)胞，但是對(duì)移植物的存活未形成明顯的影響。 5、CD4+淋巴細(xì)胞是介導(dǎo)免疫排斥反應(yīng)中的主要T細(xì)胞亞群，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比率的失調(diào)甚至逆轉(zhuǎn)導(dǎo)致個(gè)體免疫排斥的發(fā)生。 6、激活的CD4+ TO淋巴細(xì)胞經(jīng)歷了向Tl誘導(dǎo)分化的免疫偏移，高水平表達(dá)的T