Jak2信號缺陷可選擇性抑制DC而對LPS所致內(nèi)毒性休克產(chǎn)生保護.pdf

1、本文主要內(nèi)容如下：
　　 一、研究背景：
　　內(nèi)毒素性休克臨床特征表現(xiàn)為嚴重的毒血癥，伴低血壓和器官低灌注，且對液體復蘇反應欠佳，是ICU中致死的最常見病因之一，死亡率高達20%～80%，僅在美國每年超過10萬名患者死于該癥。
　　 DC屬固有免疫細胞，其通過攝取抗原、分泌促炎性因子等參與固有免疫應答。同時，DC作為體內(nèi)最重要的抗原提呈細胞，也是介導適應性免疫應答的關鍵細胞，其機制為：①加工、處理、提呈外源性抗原

2、，提供T細胞活化的第一信號；②激活的DC高表達共刺激分子，提供T細胞活化所需的第二信號；③產(chǎn)生多種細胞因子，輔助淋巴細胞活化。因而，以DC為代表的APC被認為是連接固有免疫和適應性免疫的橋梁。
　　 本研究建立誘導性Jak2基因敲除小鼠模型，并獲如下發(fā)現(xiàn)：①Jak2基因缺陷可抑制DC的固有免疫功能，表現(xiàn)為發(fā)育受阻，低表達MHC 分子和共刺激分子，且在LPS 刺激下分泌細胞因子的能力下降；②Jak2基因缺陷并不影響DC介導適應性免

3、疫應答的能力；③Jak2基因敲除小鼠對LPS所致的內(nèi)毒素性休克有很強抵抗作用。
　　 二、誘導性Jak2基因敲除小鼠模型的建立及功能分析：
　　 1.Cre+/+Jak2fl/fl小鼠模型建立
　　 本文用Jak2 fl/fl小鼠和他莫昔芬誘導性Cre轉(zhuǎn)基因小鼠進行雜交，成功復制誘導性Jak2基因敲除小鼠模型。對8 周齡雄性Cre+/+Jak2 fl/fl小鼠腹腔注射他莫昔芬（1.0mg/40g 體重）/次，每天

4、一次，連續(xù)5天，注射溶劑的同窩雄性小鼠作為對照。最后一次注射2 周后處死小鼠，培養(yǎng)BMDC和脾細胞，提取蛋白，借助Western blot分析Jak2表達，以驗證基因敲除效果。結(jié)果顯示；對照小鼠BMDC高表達Jak2，而他莫昔芬誘導的小鼠DC中未檢出Jak2，脾細胞也獲類似結(jié)果，表明在他莫昔芬誘導后，Cre+/+Jak2 fl/fl小鼠Jak2表達缺失。
　　 2.Jak2基因敲除小鼠DC功能的改變：
　　 (1)Jak

5、2基因缺陷抑制DC發(fā)育：采集Ja k2-/-小鼠和對照小鼠骨髓細胞，用GM-CSF和IL-4誘導分化為BMDC。結(jié)果證實：①Jak2基因缺陷組BMDC數(shù)量降低1.3 倍；②Jak2基因缺陷組脾細胞總數(shù)明顯降低，脾臟DC數(shù)量及在脾細胞中所占比例均降低；③Jak2基因缺陷組CD4+和CD8+T細胞百分比未見明顯變化。上述結(jié)果表明：Jak2 功能缺陷可明顯影響DC發(fā)育。
　　 (2)Jak2基因缺陷抑制DC成熟和分泌細胞因子：培養(yǎng)第9

6、天取部分DC，用LPS刺激24小時，于第10天收集DC，流式細胞術分析表型。
　　 結(jié)果顯示：①Jak2基因敲除組和對照組DC純度均大于85%；②Jak2基因敲除組BMDC表面MHC II 類分子和共刺激分子表達均明顯下降；③對單個脾DC檢測，所得結(jié)果與BMDC相似；④Jak2基因敲除組巨噬細胞表型改變類似于DC。上述結(jié)果提示：Jak2基因缺陷可抑制DC成熟。
　　 進一步檢測Jak2缺陷對DC功能的影響。采集BMDC培

7、養(yǎng)上清，借助ELISA檢測相關細胞因子分泌：①LPS刺激前，Jak2-/-和對照BMDC上清中均未能檢出IL-2、IL-6、IL-10和IL-12，Jak2-/-組可檢出低水平TNF-α；②LPS 刺激后，對照檢查組BMDC分泌大量促炎性細胞因子，而Jak2-/-BMDC所分泌相應細胞因子水平明顯低于對照組；③LPS刺激后，Jak2-/-和野生型BMDC均未檢出IL-2和IL-10。述結(jié)果顯示：Jak2基因缺陷可明顯抑制DC分泌炎性細胞

8、因子。
　　 (3)Jak2缺陷不影響DC啟動適應性免疫應答：借助同種異體混合淋巴細胞培養(yǎng)檢測DC刺激T細胞增殖的能力。經(jīng)射線照射的Jak2-/-和野生型BMDC與BALB/c小鼠T細胞共培養(yǎng)，用3 H標記的胸腺嘧啶摻入實驗檢測T細胞增殖。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Jak2-/-DC能刺激T細胞分泌IFN-γ、IL-10和IL-17，其分泌水平與野生型DC刺激T細胞分泌的水平無顯著差異。上述結(jié)果顯示，Jak2缺陷僅選擇性抑制DC

9、的固有免疫功能，但不影響DC介導適應性免疫應答的功能。
　　 三、Jak2缺陷對致死性內(nèi)毒素性休克的保護作用：
　　內(nèi)毒素性休克屬經(jīng)典的炎性疾病，固有免疫異常在發(fā)病中起關鍵性作用。為探討Jak2 調(diào)控固有免疫的效應，本文復制內(nèi)毒素性休克模型，方法為：給予他莫昔芬4 周，注射致死劑量LPS 至Jak2基因敲除和野生型小鼠腹腔內(nèi)。LPS 注射數(shù)小時后發(fā)現(xiàn)野生型小鼠的一般狀態(tài)明顯比Jak2基因敲除小鼠差，表現(xiàn)為發(fā)抖，蜷縮于鼠籠

10、一角。兩組小鼠內(nèi)毒素性休克存活率分別為22%和85%。
　　 四、Jak2調(diào)控DC功能的相關信號通路：
　　 1.Jak2缺失抑制STAT4、STAT45、STAT46活化
　　 Jak2可激活眾多STAT 分子而啟動不同下游效應。本文用LPS刺激Jak2缺陷型和野生型BMDC，30 分鐘后用100μl 裂解液RIPA裂解BMDC，借助Western blot 技術檢測下游信號分子的活化。結(jié)果顯示：Jak2缺陷型

11、BMDC裂解產(chǎn)物中，STAT4、STAT5和STAT6 磷酸化水平降低，而STAT1活化水平無明顯改變，裂解液中未檢出活化形式的STAT3。
　　 鑒于NF-κB是LPS的主要信號通路，我們檢測兩組DC在LPS 刺激后的磷酸化IκB-α及NF-κB 水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：LPS刺激30分鐘后，兩組間磷酸化的IκB-α和總NF-κB水平無明顯差異。
　　 2.Jak2-STAT5 通路促進DC發(fā)育和成熟
　　 應用STA

12、T5轉(zhuǎn)基因小鼠模型探討STAT5信號通路參與固有免疫應答的效應：①分離STAT5轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟細胞和骨髓細胞，誘導BMDC生成，Western檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠STAT5表達明顯高于對照小鼠；②STAT5轉(zhuǎn)基因陽性小鼠脾臟細胞數(shù)量明顯高于轉(zhuǎn)基因陰性的同窩對照小鼠和野生型對照小鼠；③流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，STAT5 過表達小鼠脾臟細胞中DC比例上調(diào)；④應用GM-CSF和IL-4誘導STAT5轉(zhuǎn)基因小鼠和對照小鼠骨髓細胞分化為DC，STAT5

13、 過表達可增加BMDC數(shù)量；⑤在刺激或未刺激條件下，STAT5 過表達BMDC中MHC II陽性細胞群、CD80 陽性細胞群、CD86 陽性細胞群和CD54 陽性細胞群比例均顯著上調(diào)；⑥LPS 刺激前后，STAT5轉(zhuǎn)基因BMDC分泌TNF-α和IL-6 水平與對照BMDC無顯著區(qū)別；⑦LPS 刺激后，STAT5 過表達BMDC分泌IL-12 水平比對照BMDC明顯升高。上述結(jié)果表明，Jak2 功能喪失可通過下調(diào)STAT5 而抑制DC發(fā)育

14、、成熟。
　　 3.Jak2-STAT6通路調(diào)節(jié)DC分泌炎性細胞因子
　　 鑒于STAT5 僅影響DC分泌IL-12，提示可能存在其他通路影響LPS 刺激后DC分泌炎性細胞因子。采集STAT4基因敲除小鼠、STAT6基因敲除小鼠和野生型對照小鼠骨髓細胞，誘導生成BMDC，第9天用LPS 刺激BMDC，24 小時后采集培養(yǎng)上清，ELISA檢測促炎性細胞因子分泌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　 (1)未受LPS 刺激，STAT6-

15、/-BMDC分泌IL-6和TNF-α水平明顯高于野生型對照組；各組BMDC均未檢出IL-12。由此提示：STAT6基因缺陷可降低BMDC對LPS的反應性。
　　 (2)LPS 刺激24 小時后，STAT6-/-BMDC分泌TNF-α和IL-12 均明顯低于對照組，IL-6 水平與對照組無明顯差異。考慮到刺激前基礎分泌水平，LPS 刺激促進DC分泌炎性因子的效應在STAT6 缺陷組明顯低于其他組。LPS 刺激后，野生型BMDC分泌

16、IL-6和TNF-α水平分別升高40 倍和244 倍，而STAT6 缺陷BMDC僅分別升高6.5和12.9 倍。
　　 (3)STAT4基因缺陷并不影響DC分泌炎性因子，LPS 刺激后，STAT4-/-BMDC分泌TNF-α升高倍數(shù)低于對照BMDC。
　　 LPS 刺激后，TAT4-/-BMDC分泌3種炎性細胞因子的水平與野生型對照無明顯差異。以上結(jié)果提示：Jak2 缺失可通過STAT6 途徑而影響DC分泌炎性細胞因子。

17、
　　 五、結(jié)論：
　　 1.Jak2基因敲除可抑制DC發(fā)育、成熟和分泌細胞因子。
　　 2.Jak2基因缺陷不影響DC引發(fā)適應性免疫應答的功能。
　　 3.Jak2基因敲除小鼠對致死劑量LPS所致內(nèi)毒素性休克有抵抗作用，此效應與抑制DC分泌炎性因子相關。
　　 4.Jak2 缺陷可影響STAT4、5、6活化；Jak2/STAT5信號通路參與調(diào)控DC發(fā)育、成熟；Jak2/STAT6通路參與調(diào)控DC