ABCE1基因與肺腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的相關(guān)性及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：肺癌最重要的生物學(xué)特征就是浸潤和轉(zhuǎn)移,其浸潤和轉(zhuǎn)移的程度影響癌癥患者的預(yù)后和治療效果,進(jìn)一步研究肺癌惡性生物學(xué)行為的分子學(xué)基礎(chǔ)至關(guān)重要。
　　 本課題組前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)采用激光顯微俘獲切割(LCM)及mRNA差異顯示等技術(shù),在肺癌標(biāo)本中篩選和克隆出多個(gè)與肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因片段,應(yīng)用RACE技術(shù)對(duì)新基因進(jìn)行了全長cDNA的克隆及測序,并與Genebank序列進(jìn)行了對(duì)比,發(fā)現(xiàn)新的肺癌相關(guān)基因ABCE1。ABCE1基因?qū)貯TP結(jié)合盒

2、轉(zhuǎn)運(yùn)子基因亞家族,它的CDNA編碼一種分子量為68KD的蛋白,又稱核糖核酸酶L抑制因子。ABCE1蛋白位于細(xì)胞漿,分布于人體多處組織,能夠阻斷干擾素介導(dǎo)的2-5A/Rnase L細(xì)胞抗病毒通路,抑制細(xì)胞凋亡過程,并可能在促進(jìn)蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞增殖分化過程中發(fā)揮著作用。
　　 我們經(jīng)過體外RNAi實(shí)驗(yàn)篩選ABCE1基因靶向的高效siRNA分子,并以此抑制SPCA1肺癌細(xì)胞ABCE1基因的表達(dá),通過增殖能力、生長曲線、粘附實(shí)驗(yàn)、劃痕修

3、復(fù)實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)等體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn),研究ABCE1基因表達(dá)抑制后,SPCA1肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的變化及分子機(jī)制。
　　 Rho/Rho激酶是具有信息傳導(dǎo)和分子開關(guān)功能的信號(hào)多肽。Rho家族蛋白是Ras超家族的一員,是一組相對(duì)分子量大約為20-25kD的三磷酸鳥苷(GTP)結(jié)合蛋白,具有GTP酶活性,又稱為Rho GTP酶。Rho GTP酶通過GTP結(jié)合形式和GDP解離形式的轉(zhuǎn)換,起著分子開關(guān)的作用。R

4、ho/Rho激酶通路具有調(diào)控細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞與基質(zhì)粘附及細(xì)胞骨架重組等生物學(xué)行為的作用。Rho激酶通路對(duì)于腫瘤細(xì)胞生長、浸潤、轉(zhuǎn)移有著重要作用,Rho家族的一些成員在膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤組織中過表達(dá)。
　　 本研究應(yīng)用Rho激酶特異性抑制劑—法舒地爾干預(yù)95D肺腺癌細(xì)胞,觀察此時(shí)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的改變,從而評(píng)價(jià)Rho/Rho激酶通路在肺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移過程中的作用。
　　 方法：應(yīng)用美國Ambion

5、公司在線siRNA設(shè)計(jì)工具,針對(duì)ABCE1基因編碼區(qū)進(jìn)行干擾靶點(diǎn)的設(shè)計(jì),在設(shè)計(jì)結(jié)果中根據(jù)Reynolds高效siRNA設(shè)計(jì)原則進(jìn)行篩選,構(gòu)建攜帶綠色熒光且可用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的ABCE1基因沉默siRNA質(zhì)粒,經(jīng)電泳和DNA測序驗(yàn)證,證實(shí)ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功。將ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA轉(zhuǎn)染SPCA1肺腺癌細(xì)胞株,G418篩選穩(wěn)定封閉ABCE1基因的肺癌細(xì)胞株,結(jié)合RT

6、-PCR,Western Blot檢測RNA干擾效率。通過檢測細(xì)胞增殖能力、生長曲線、粘附實(shí)驗(yàn)、劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)等體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)體外ABCE1基因穩(wěn)定沉默后,SPCA1肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的變化及分子機(jī)制。用MTT方法檢測Rho激酶特異性抑制劑—法舒地爾對(duì)95-D肺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng),測定其IC50值。應(yīng)用法舒地爾干預(yù)95-D肺腺癌細(xì)胞,通過粘附實(shí)驗(yàn)、劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)、免疫組化

7、,RT-PCR、Western Blot和明膠酶譜分析等體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)選擇性抑制Rho激酶通路活性后95-D肺癌細(xì)胞增殖和遷移能力的變化。
　　 結(jié)果：成功的構(gòu)建了攜帶綠色熒光且可用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的ABCE1 siRNA表達(dá)載體ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA。將其轉(zhuǎn)染SPCA1肺腺癌細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48小時(shí)后轉(zhuǎn)染效率較高,可達(dá)到50％以上,經(jīng)G418篩選,成功篩選出了穩(wěn)定封閉ABCE1基因的SPCA1肺腺癌細(xì)胞株

8、。經(jīng)RT-PCR,Western Blot檢測顯示,RNAi后SPCA1肺腺癌細(xì)胞ABCE1基因的mRNA和蛋白水平明顯受到抑制。與對(duì)照組相比,穩(wěn)定封閉ABCE1基因后,SPCA1肺腺癌細(xì)胞的增值能力明顯下降;生長曲線上升緩慢,增殖幅度降低,細(xì)胞生長明顯延緩;粘附能力明顯下降(P＜0.05);遷移和侵襲能力均明顯降低(P＜0.01)。法舒地爾對(duì)95-D肺腺癌細(xì)胞的IC50值約為0.79 mg/ml(95％可信區(qū)間:0.58-1.11 m

9、g/ml)。用0.75 mg/ml法舒地爾干預(yù)95D肺腺癌細(xì)胞,法舒地爾組與對(duì)照組相比:95D肺腺癌細(xì)胞粘附能力明顯降低(P＜0.05);免疫組化檢測顯示遷移相關(guān)蛋白—基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達(dá)明顯下降;明膠酶譜分析檢測顯示MMP-2和MMP-9分別下降22.7％(P＜0.05)和65.9％(P＜0.01);Western blot檢測顯示肌球蛋白磷酸酶靶標(biāo)亞基1(MYPT1)和MYPT1磷酸化水平(p-MYPT1)分別下降了

10、13.9％(P＞0.05)和29.4％(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功的構(gòu)建了攜帶綠色熒光且可用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的ABCE1 siRNA表達(dá)載體ABCE1-pRNAT-U6.1/Neo-siRNA;
　　 2、成功篩選出了穩(wěn)定封閉ABCE1基因的SPCA1肺腺癌細(xì)胞株。;
　　 3、體外行RNAi封閉ABCE1基因表達(dá)后可抑制SPCA1肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力;
　　 4、選擇性抑