支氣管哮喘外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷與氧化應(yīng)激的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:檢測(cè)支氣管哮喘患者外周血淋巴細(xì)胞DNA損傷和血漿MPO、MDA含量,探討DNA損傷與氧化應(yīng)激的相關(guān)性,從而為哮喘的防治提供新的思路。
　　 方法:1.以支氣管哮喘患者為研究對(duì)象,20例重癥哮喘患者作為重度組,9例輕度哮喘患者作為輕度組、9例健康體檢者作為正常組。肘靜脈采血檢測(cè)淋巴細(xì)胞DNA損傷及血漿MPO、MDA含量。2.彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)淋巴細(xì)胞DNA損傷:枸櫞酸化的靜脈血2ml與HanK’s液2ml混勻,小心加于2ml淋巴細(xì)

2、胞分離液的表面上,1500轉(zhuǎn)／分離心15分鐘,收集分界處淋巴細(xì)胞,再次1500轉(zhuǎn)／分離心10分鐘,收集新鮮的淋巴細(xì)胞沉淀20μl與0.7％低熔點(diǎn)凝膠75μl混勻后,鋪于預(yù)先鋪有加熱的1％正常熔點(diǎn)凝膠的載玻片上,加蓋玻片,4℃冷藏放置10分鐘使膠牢固。移去蓋玻片,將載玻片放入裝有預(yù)冷的細(xì)胞裂解混懸液中,4℃下裂解至少1小時(shí)。取出載玻片用生理鹽水漂洗兩次,置入堿性電泳緩沖液中,室溫放置20分鐘使DNA堿解旋,然后電泳(25 V／300 mA

3、,20 min)。電泳后取出載玻片,生理鹽水漂洗兩次。溴化乙錠避光染色(70μl／玻片)10分鐘。應(yīng)用熒光顯微鏡(激發(fā)光波長(zhǎng)515-560nm),200倍視野觀察核DNA和遷移DNA,每個(gè)樣本選取50個(gè)細(xì)胞拍照,圖片保存后應(yīng)用TriTek CometScoreTM軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析,以尾長(zhǎng)(TL)和尾距(TM)為指標(biāo),觀察DNA損傷程度。3.血漿MPO含量的測(cè)定:應(yīng)用ELISA測(cè)定血漿中MPO的水平。向預(yù)先包被了MPO單克隆抗體的酶標(biāo)孔

4、中加入MPO,溫育；洗滌后,加入HRP標(biāo)記過(guò)的MPO抗體。再經(jīng)過(guò)溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶,然后加入底物A、B,產(chǎn)生藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中MPO的濃度呈正相關(guān)。在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD值,計(jì)算樣本中MPO含量。4.血漿MDA含量的測(cè)定:過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與硫代巴比妥酸縮合,生成紅色產(chǎn)物,在532nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰,應(yīng)用比色法測(cè)定吸光度值,用計(jì)算公式計(jì)算血漿MD

5、A含量。
　　 結(jié)果:1.淋巴細(xì)胞DNA損傷觀察。①尾長(zhǎng)(TL)比較:重度組與輕度組和正常組TL比較,重度組明顯高于輕度組和正常組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；輕度組與正常組比較,輕度組高于正常組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。②尾距(TM)比較:重度組與輕度組和正常組TM比較,重度組明顯高于輕度組和正常組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；輕度組與正常組比較,無(wú)明顯差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。2.血漿MPO含量變化:重度

6、組血漿MPO含量明顯高于輕度組和正常組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；輕度組和正常組比較,高于正常組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。3.血漿MDA含量變化:重度組血漿MDA含量明顯高于輕度組和正常組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；輕度組和正常組比較,輕度組高于正常組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。4.相關(guān)性分析顯示:重度組TL與TM之間呈正相關(guān)(p<0.01)；重度組TL與MPO含量之間呈正相關(guān)(p<0.01),重度組TM與MPO含量之

7、間呈正相關(guān)(p<0.01)；重度組TL與MDA含量之間呈正相關(guān)(p<0.01)；重度組TM與MDA含量之間呈正相關(guān)(p<0.01),重度組MPO含量與MDA含量之間呈正相關(guān)(p<0.01)。各組詳細(xì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見圖表。
　　 結(jié)論:1.支氣管哮喘急性發(fā)作時(shí)存在明顯淋巴細(xì)胞DNA損傷,病情越重,損傷越明顯。2.哮喘急性發(fā)作期氧化應(yīng)激指標(biāo)血漿MPO和MDA明顯升高,重癥哮喘尤為明顯。3.哮喘患者外周血氧化應(yīng)激指標(biāo)MPO、MDA含量與淋巴