TiO2-SiO2復(fù)合固相萃取填料的研究及其在血清磷脂組學(xué)中的應(yīng)用.pdf

1、磷脂(phospholipids,PLs)是脂質(zhì)化合物中的第一大類,其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了它是兩性生物分子。磷脂是構(gòu)成細(xì)胞膜的主要成分,此外,磷脂在體內(nèi)還有很多重要功能,包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡,氧化應(yīng)激和炎癥等,越來越多的研究發(fā)現(xiàn),在諸多重大惡性疾病包括癌癥的發(fā)生、發(fā)展中都伴隨著磷脂代謝的紊亂以及有關(guān)代謝酶活性的變化,因此磷脂化合物有潛力作為疾病的信號分子用于臨床監(jiān)測。磷脂結(jié)構(gòu)復(fù)雜,種類多樣,給它的分析和鑒定帶來挑戰(zhàn)。目前,在磷脂提取方

2、面應(yīng)用較多的方法主要是液液萃取法(liquid-liquid extraction, LLE)和固相萃取法(solid-phase extraction,SPE),后者有機(jī)溶劑用量較少,是一種快速可靠的前處理方法,常用的SPE填料包括氨基或二醇基修飾的硅膠等,但這些填充材料對磷脂類物質(zhì)的選擇性和特異性偏低。
　　金屬氧化物(如Ti02)在一定的條件下可以表現(xiàn)為路易斯酸或堿,它可以在酸性條件下吸附帶有磷酸基團(tuán)的化合物,而在堿性條件下

3、解吸附。故將金屬氧化物在特異性吸附磷脂方面有廣闊的前景,但Ti02本身比表面積小,顆粒粒徑小,無多孔結(jié)構(gòu),不適合做SPE固相萃取填料, Ti02修飾的多孔二氧化硅微球表現(xiàn)出比單純Ti02更好的吸附性能和特異性。本文利用水蒸氣內(nèi)部水解法,將Ti02負(fù)載在二氧化硅微球表面,制備Ti02/Si02復(fù)合微球,并用于SPE前處理中特異性富集磷脂,以反相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器( reversed-phase liquid chromatograph

4、y- evaporative light scattering detector, RPLC-ELSD)為平臺,對該方法進(jìn)行優(yōu)化并考察其對磷脂標(biāo)準(zhǔn)品的回收率和吸附性能。將建立的SPE方法用于血清中磷脂的提取并以超高效液相色譜一四級桿飛行時間質(zhì)譜( ultra performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UPLC-Q

5、TOF MS)為平臺進(jìn)行血清磷脂輪廓分析和淋巴瘤磷脂組學(xué)研究,為淋巴瘤的早期診斷奠定研究基礎(chǔ)。
　　本文的主要內(nèi)容有:
　　1.利用水蒸氣內(nèi)部水解法制備包覆不同比例二氧化鈦的二氧化硅( Ti02/Si02)復(fù)合填料,然后對制備的材料進(jìn)行表征,包括掃描電子顯微鏡( SEM)觀察其外貌形態(tài)、X-射線衍射(XRD)判斷金屬氧化物的無定型狀態(tài)、紫外可見漫反射(UV-vis DRS)考察復(fù)合填料的紫外吸收特征峰和氮?dú)馕浇馕鼘?shí)驗(yàn)(BE

6、T)考察材料的平均粒徑、比表面積等參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Ti02/Si02復(fù)合填料的比表面積達(dá)到 m2/g,比純Ti02的比表面積m2/g提高了近倍,平均孔徑為nm本身比表面積小,顆粒粒徑小,無多孔結(jié)構(gòu),不適合做SPE固相萃取填料, Ti02修飾的多孔二氧化硅微球表現(xiàn)出比單純Ti02更好的吸附性能和特異性。本文利用水蒸氣內(nèi)部水解法,將Ti02負(fù)載在二氧化硅微球表面,制備Ti02/Si02復(fù)合微球,并用于SPE前處理中特異性富集磷脂,以反相

7、色譜一蒸發(fā)光散射檢測器( reversed-phase liquid chromatography- evaporative light scattering detector, RPLC-ELSD)為平臺,對該方法進(jìn)行優(yōu)化并考察其對磷脂標(biāo)準(zhǔn)品的回收率和吸附性能。將建立的SPE方法用于血清中磷脂的提取并以超高效液相色譜一四級桿飛行時間質(zhì)譜( ultra performance liquid chromatography with qua

8、drupole time-of-flight mass spectrometry, UPLC-QTOF MS)為平臺進(jìn)行血清磷脂輪廓分析和淋巴瘤磷脂組學(xué)研究,為淋巴瘤的早期診斷奠定研究基礎(chǔ)。且分布均勻,Ti02以無定型、高度不飽和Tj4+形式均勻地分散在Si02微球表面。
　　2.將實(shí)驗(yàn)制備的Ti02/Si02復(fù)合填料填充于SPE小柱用于特異性吸附磷脂的研究。以RPLC-ELSD為分析平臺,對Ti02負(fù)載率、SPE上樣液、洗脫液、

9、洗脫體積等影響磷脂回收率的因素進(jìn)行了考察,以5種磷脂標(biāo)準(zhǔn)品的回收率為指標(biāo),對SPE方法進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Ti02/Si02復(fù)合材料比純金屬氧化物對磷脂標(biāo)準(zhǔn)品有更高的回收率,且以wt％ Ti02/Si02的回收率最高,五個標(biāo)準(zhǔn)品的回收率在85%-93%范圍內(nèi),遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于純Ti02的回收率%-53%。SPE方法以含1%甲酸的正己烷一異丙醇(2:8,V:V)為上樣液,以正己烷一異丙醇(2:8, V:V)為洗脫液,以uL7 M氨甲醇作為洗脫

10、液時得到較高的回收率。此外,在RPLC-ELSD譜圖中,含磷脂標(biāo)準(zhǔn)品的上樣液經(jīng)SPE直接流出液以及淋洗液的譜圖中均沒有出現(xiàn)磷脂標(biāo)準(zhǔn)品的特征峰,說明磷脂被吸附在SPE小柱上,在洗脫液色譜圖中看到個磷脂的色譜峰,說明吸附在柱上的磷脂被洗脫回收,證明本實(shí)驗(yàn)制備的Ti02/Si02材料具有良好的吸附磷脂特性。
　　3.將建立的SPE方法用于血清樣品的前處理中,以UPLC-QTOF MS聯(lián)用技術(shù)為檢測平臺,檢測順序依次為未經(jīng)SPE萃取柱的提

11、取液,經(jīng)過SPE步驟的上樣流出液、淋洗液和洗脫液,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)過SPE方法能夠檢測到527個物質(zhì),而未經(jīng)過SPE方法直接上樣檢測到的物質(zhì)個數(shù)為,故SPE方法比傳統(tǒng)方法可以多檢測到.7%分子特征峰信息;另外,洗脫后的血清樣品中化合物與未經(jīng)過SPE處理的樣品相比,信號響應(yīng)強(qiáng)度有不同程度的提高。本研究為大規(guī)模的磷脂組學(xué)研究,尤其是低豐度磷脂檢測提供了新的方法平臺。
　　4.將上述方法進(jìn)一步應(yīng)用于淋巴瘤磷脂組學(xué)研究,將正常人和淋巴瘤患

12、者的血清樣品用Ti02/Si02-SPE方法進(jìn)行預(yù)處理,然后用UPLC-QTOF MS獲取磷脂代謝輪廓譜圖,利用MassLynx和Simca-P11.5軟件分別對數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理及多維統(tǒng)計(jì)分析。主成分分析法PCA對各組樣本之間的總體分布及整個分析批次的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察,顯示實(shí)驗(yàn)批次中穩(wěn)定性良好;再利用正交偏最小二乘法判別分析 OPLS-DA對各組間代謝輪廓的總體差異進(jìn)行分析,通過建模分析中 VIP>1和t-test檢驗(yàn)p<o.