抗FⅧ-C2區(qū)單克隆抗體的制備及功能研究.pdf

1、血栓性疾病嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康，血栓形成的機(jī)制和防治的研究是醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域重大課題之一。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)VIII水平升高已經(jīng)成為動(dòng)靜脈血栓形成的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，高水平的FVIII主要通過(guò)凝血途徑增加凝血酶和纖維蛋白形成率以及刺激凝血酶生成進(jìn)一步引起血小板激活和纖維蛋白的形成等機(jī)制參與動(dòng)靜脈血栓的形成。而且，研究發(fā)現(xiàn)FVIII水平降低對(duì)于缺血性心臟病有保護(hù)作用。在血友病A患者中由于缺血性心臟病死亡的人數(shù)明顯低于正常男性人群，這提示FVIII參

2、與了動(dòng)脈血栓的發(fā)病機(jī)制。另一方面，對(duì)血友病A的患者觀察發(fā)現(xiàn)發(fā)生靜脈血栓的情況很少。這些結(jié)果均提示通過(guò)抑制FVIII活性來(lái)進(jìn)行抗栓治療是可能的。 作為一種具有靶向性的生物大分子，單克隆抗體始終是人們關(guān)注的熱點(diǎn)之一，被廣泛用于治療腫瘤、病毒感染以及抗移植排斥等多種疾病。臨床應(yīng)用取得了較好效果，顯示了單克隆抗體藥物治療疾病的良好前景。其所具有的特異性以及藥代動(dòng)力學(xué)特征亦為預(yù)防和治療血栓性疾病提供了新的方向。FVIII-C2區(qū)含有與vW

3、F、PS、FXa以及凝血酶等蛋白結(jié)合的位點(diǎn)，具有重要的病理生理功能。因此，本研究制備了針對(duì)FVIII-C2區(qū)的單克隆抗體并對(duì)其功能及機(jī)制進(jìn)行了研究。試驗(yàn)分三部分：(1)在大腸桿菌中表達(dá)了FVIII-C2區(qū)蛋白并研究了其功能；(2)用rFVIII-C2區(qū)蛋白作為抗原免疫Balb/c小鼠，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體技術(shù)制備并鑒定了一株FVIII-C2區(qū)單克隆抗體SZ-132；(3)研究了SZ-132抑制FVIII促凝活性，并通過(guò)研究SZ-132抑制r

4、hFVIII-vWF、rhFVIII-PS結(jié)合試驗(yàn)以及SZ-132抑制rhFVIII與血小板的結(jié)合來(lái)闡明SZ-132抑制FVIII促凝活性的可能機(jī)制。 第一部分人 FVIII-C2區(qū)在大腸桿菌中的表達(dá)及功能研究 FVIII是內(nèi)源性凝血途徑中一個(gè)重要的輔因子，其包涵2332個(gè)氨基酸。由A1-A2-A3-B-C1-C2結(jié)構(gòu)域組成，其中C2區(qū)含有與血管性血友病因子(vWF)、磷脂(PL)等結(jié)合的位點(diǎn)。在血漿中，F(xiàn)VIII通過(guò)

5、非共價(jià)鍵與vWF結(jié)合避免其被降解，與血小板上磷脂膜的結(jié)合對(duì)于發(fā)揮FVIII的促凝作用至關(guān)重要。因此，F(xiàn)VIII-C2區(qū)對(duì)于維持FVIII的穩(wěn)定性以及活性具有重要的意義。本研究中采用PCR技術(shù)從含有hFVIII-cDNA的質(zhì)粒中擴(kuò)增出FVIII-C2區(qū)基因，經(jīng)電泳及測(cè)序正確后，將其連接至原核表達(dá)載體pQE30中，構(gòu)建出pQE30-FVIII-C2表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)ITPG誘導(dǎo)表達(dá)后，收集細(xì)菌反復(fù)凍融，超聲破菌，SDS-PAGE電泳觀察表達(dá)蛋白的

6、存在形式，用western blot方法鑒定表達(dá)的蛋白，應(yīng)用金屬螯合層析法純化目的蛋白。ELISA法測(cè)定重組的FVIII-C2區(qū)蛋白與血管性血友病因子(vWF)和磷脂酰絲氨酸(PS)的結(jié)合。結(jié)果顯示，PCR反應(yīng)擴(kuò)增出489 bp的特異性片段，測(cè)序結(jié)果與已知的FVIII-C2區(qū)cDNA序列完全一致。重組的pQE30-FVIII-C2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌M15，經(jīng)ITPG誘導(dǎo)4-6 h后可高效表達(dá)目的蛋白，表達(dá)量占菌體總蛋白的48％左右，以包涵

7、體形式存在。Western blot結(jié)果顯示重組的蛋白能夠特異地和His抗體起反應(yīng)。ELISA法測(cè)定重組蛋白與vWF和PS結(jié)果表明，該重組蛋白呈劑量依賴(lài)方式與vWF和PS結(jié)合，說(shuō)明在FVIIIC2區(qū)含有與vWF和PS的結(jié)合位點(diǎn)。 第二部分抗FVIII-C2區(qū)特異性單克隆抗體SZ-132的研制和鑒定 FVIII水平升高已經(jīng)成為動(dòng)靜脈血栓形成的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。而且，研究發(fā)現(xiàn)FVIII水平降低對(duì)于缺血性心臟病有保護(hù)作用。在

8、血友病A患者中由于缺血性心臟病死亡的人數(shù)明顯低于正常男性人群，這提示FVIII參與了動(dòng)脈血栓的發(fā)病機(jī)制。另一方面，對(duì)血友病A的患者觀察發(fā)現(xiàn)發(fā)生靜脈血栓的情況很少。這些結(jié)果均提示通過(guò)抑制FVIII活性來(lái)進(jìn)行抗栓治療是可能的。單克隆抗體所具有的特異性以及藥代動(dòng)力學(xué)特征亦為預(yù)防和治療血栓性疾病提供了新的方向。針對(duì)血液凝固途徑中的凝血因子(如組織因子TF、FIX以及FVIII等)的單克隆抗體的研制已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。鑒于FVIII-C2區(qū)所具有

9、的重要病理生理功能，本研究應(yīng)用重組的FVIII-C2區(qū)蛋白作為抗原，免疫Balb/c小鼠，采用經(jīng)典的雜交瘤融合技術(shù)制備抗FVIII-C2區(qū)的單克隆抗體，結(jié)果獲得了一株與FVIII-C2蛋白反應(yīng)最強(qiáng)的單克隆抗體，命名為SZ-132。ELISA法及western blot結(jié)果顯示SZ-132能夠與rhFVIII及rFVIII-C2蛋白反應(yīng)，提示SZ-132是針對(duì)FVIII-C2區(qū)的特異性單克隆抗體。 第三部分抗FVIII-C2區(qū)單克

10、隆抗體SZ-132的功能研究 已有研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)FVIII的單克隆抗體能夠抑制FVIII的促凝活性，在動(dòng)物血栓模型實(shí)驗(yàn)中能夠抑制血栓的形成。本研究在體外觀察了SZ-132對(duì)FVIII促凝活性的作用。將不同濃度的SZ-132與健康成人的混合血漿孵育后，當(dāng)SZ-132濃度為0～25μg/ml時(shí)，該抗體呈劑量依賴(lài)的方式抑制FVIII活性；SZ-132對(duì)正常人新鮮混合血漿FVIII活性的抑制率為0～(95．00±3．12)％；濃度大于2

11、5μg/ml時(shí)，F(xiàn)VIII活性完全被抑制。IC50為7．96μg/ml。APTT測(cè)定顯示孵育后明顯延長(zhǎng)，當(dāng)濃度為0～25μg/ml時(shí)，APTT值為(33．4±9．8)s～(83．8±7．3)s。對(duì)照組SZ-123對(duì)FVIII活性及APTT均無(wú)影響(n=3)。為了研究SZ-132抑制FVIII活性的可能機(jī)制，本研究觀察了SZ-132對(duì)rhFVIII-vWF及rhFVIII-PS的結(jié)合的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SZ-132可以抑制上述結(jié)合反應(yīng)，在SZ

12、-132對(duì)rhFVIII-vWF結(jié)合實(shí)驗(yàn)的影響中，當(dāng)SZ-132濃度為0～100μg/ml時(shí)，在490nm處測(cè)得的OD值為(3．28±0．45)～(0．24±0．12)；而SZ-132對(duì)rhFVIII-PS結(jié)合實(shí)驗(yàn)的影響中，測(cè)得的OD值為(3．25±0．50)～(0．41±0．14)。對(duì)照組SZ-123對(duì)上述結(jié)合實(shí)驗(yàn)無(wú)影響。(n=3)。IC50分別為10．71μg/ml和9．88μg/ml。該實(shí)驗(yàn)解釋了SZ-132抑制FVIII活性的機(jī)

13、制，同時(shí)表明FVIII在vWF和PS上的結(jié)合位點(diǎn)相鄰或有重疊。本研究觀察了SZ-132對(duì)rhFVIII與血小板結(jié)合實(shí)驗(yàn)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SZ-132能夠以劑量依賴(lài)的方式抑制二者的結(jié)合。當(dāng)SZ-132濃度為0～100μg/ml時(shí)，在490nm處測(cè)得的OD值為(2．65±0．25)～(0．56±0．10)。對(duì)照組SZ-123對(duì)二者結(jié)合無(wú)影響。(n=3)。上述結(jié)果表明，SZ-132是一株針對(duì)FVIII-C2區(qū)的抑制性單克隆抗體，其可能通過(guò)抑制r