聯(lián)合激光捕獲顯微切割與二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜研究低惡性膀胱移行細胞癌蛋白表達譜和生物通路.pdf

1、目的：膀胱癌是我國最常見的泌尿腫瘤。近年來研究發(fā)現(xiàn)，膀胱移行細胞癌從生物學行為到病理形態(tài)可分成低惡性與高惡性膀胱移行細胞癌兩種類型(常被稱之為兩類癌)。兩類癌概念的提出為人們從分子與基因水平對膀胱移行細胞癌進行分類與研究提供了新的視角，并為闡明其發(fā)病機制與指導治療，以及推測預后提供了更具科學性的依據(jù)，具有重要的理論與現(xiàn)實意義。因此，本研究即是在其指引下，尋找其差異表達蛋白，探究低惡性膀胱移行細胞癌的生物標記以及發(fā)病機制，進而揭示其發(fā)病規(guī)

2、律。同時，這也正是膀胱癌研究領域亟待解決的難題之一。 方法： 1．激光捕獲顯微切割獲得正常膀胱移行上皮細胞以及腫瘤細胞：采用Pix CellⅡLCM激光捕獲顯微切割設備獲得正常移行上皮以及腫瘤細胞各250，000shots，裂解后分別獲得 185.2μg、147.6μg總蛋白，為進一步質(zhì)譜分析奠定基礎。 2．使用Finnigan線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀(LTQ)進行液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜鑒定正常上皮以及腫瘤細胞的蛋白質(zhì)表

3、達譜，將實驗結果與目前已經(jīng)證實的膀胱癌及腫瘤差異表達蛋白進行比較，同時選擇2個差異表達蛋白質(zhì)進行免疫蛋白印跡以及免疫組織化學驗證。 3．生物信息學工具分析鑒定的蛋白質(zhì)：使用蛋白質(zhì)分析工具鑒定蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)，包括總體平均親水性，跨膜區(qū)預測，分子量以及等電點。并初步對比正常上皮細胞蛋白質(zhì)表達與腫瘤細胞表達蛋白的理化性質(zhì)。 4．以本表達譜中鑒定的蛋白質(zhì)為基礎為蛋白質(zhì)生物標記尋找進行循證生物醫(yī)學探索，以期得到生物標記蛋白基

4、本理化性質(zhì)的特點。 5．GO軟件分析腫瘤蛋白質(zhì)表達譜以及差異表達蛋白質(zhì)譜。GO分析的同時計算GO濃集/缺失表達，以了解腫瘤的細胞生理，并與尿液中蛋白質(zhì)的GO分析比對，探索尿液中侯選生物標記蛋白的來源。 6．通路分析及可視化。將正常上皮細胞以及腫瘤細胞差異表達蛋白質(zhì)的IPI標記號轉化為SWISSPORT-ACC-NUMBER，然后輸入ArrayTrack V.3.3.0 軟件包，對目前已知的生物通路進行基因差異表達分析，

5、檢索生物通路數(shù)據(jù)庫為KEGG。將差異表達蛋白質(zhì)的IPI標記號轉化為Protein-RefSeQ，按照軟件要求的格式輸入GenMAPP軟件，實現(xiàn)生物通路的可視化。同樣的方法分析高惡性移行上皮癌的蛋白質(zhì)表達譜為進一步分析兩類癌的不同分子機制奠定基礎。 結果： 1．蛋白質(zhì)表達譜結果：440個蛋白質(zhì)表達于腫瘤細胞，其中24個假定蛋白，24個疏水性蛋白質(zhì)(5．5％)，TMHMM程序預測跨膜蛋白38個(8．6％)，84個(19．1％

6、)蛋白質(zhì)PI>9；76個(17．3％)蛋白質(zhì)分子量<10 kDa或者>100 kDa。 2．免疫蛋白印跡以及免疫組織化學結果顯示：NHERF在腫瘤組織中的表達明顯上調(diào) (P<0．05)，TPD52 在腫瘤組織中特異性表達 (P<0．05)。免疫組織化學結果顯示：TPD52和NHERF 在膀胱癌中的表達陽性率明顯高于正常膀胱粘膜中的表達陽性率，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0．01)。膀胱癌組織中TPD52 的陽性表達率隨著腫瘤病理分級

7、的升高而增加 (P<0．05)，而與腫瘤浸潤深度不具相關性(P>0．05)。NHERF 的表達與膀胱癌的病理分級、浸潤深度均不具相關性(P>0．05)。 3．循證生物醫(yī)學探索結果：129個蛋白質(zhì)被定義為生物標記，其他蛋白為非生物標記，這兩個蛋白組間PI，MW，GRAVY，跨膜區(qū)均沒有統(tǒng)計學差異。按照PI區(qū)分蛋白質(zhì)時，71個蛋白PI>9，317個蛋白PI≤9，這兩個組中分別有21和108個蛋白被定義為生物標記，這兩個組之間的生物標

8、記和非生物標記的PI均數(shù)以及標準差之間沒有統(tǒng)計學差異。 4.GO分析結果：低惡性膀胱移行上皮癌中共鑒定440個蛋白質(zhì)。按人類 GO slimv1.8劃分440個蛋白質(zhì)中具有生物學途徑、細胞成分、分子功能注解的蛋白質(zhì)分別為312個(70.9％)、304個(69.1％)、346個(78.6％)。按照GO 4級分支術語生物學途徑、細胞成分、分子功能中濃集/缺失表達的蛋白分別為 41/22、25/11、23/20種。按人類GO slim

9、 v1.8 劃分差異表達蛋白質(zhì)中具有生物學途徑、細胞成分、分子功能注解的蛋白質(zhì)分別為267個(68.8％)、256個(66.0％)、297個(76.5％)。細胞黏附、細胞增殖、細胞循環(huán)、細胞分化、細胞信號傳導途徑中的蛋白質(zhì)分別為10、13、9、10、37個。 5.數(shù)據(jù)庫的構建：數(shù)據(jù)庫包括4個主要內(nèi)容：標本信息、實驗過程、質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)、GO分析結果。質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)中包括蛋白質(zhì)名稱、蛋白質(zhì)描述、多個蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的登陸號、MW以及PI、

10、總體平均疏水性、跨膜結構。蛋白質(zhì)的交叉數(shù)據(jù)庫標記號也包括在質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)中，包括IPI，Swiss-port，TrEMBL，RefSeQ，Ensembl和H-Inv等。質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)采用XML格式。GO分析結果采用表格形式來描述蛋白質(zhì)的生物學途徑、分子功能以及細胞組分。按照GO分支術語將蛋白質(zhì)聚類，儲存于同一數(shù)據(jù)層，同時包括蛋白質(zhì)的濃集/缺失表達分析。鑒定蛋白質(zhì)的IPI標記號在數(shù)據(jù)庫中與GO分支術語直接關聯(lián)，因此擁有共同GO分支術語的蛋白列

11、表于同一數(shù)據(jù)層，GO分析中同時包含GO濃集/缺失表達分析。在數(shù)據(jù)庫中，用戶可以在GO等級術語蛋白質(zhì)列表中指定感興趣的蛋白質(zhì)，通過超鏈接可以獲得儲存于歐洲生物信息學研究所的GO術語信息以及蛋白質(zhì)信息。同時為了方便用戶查詢，數(shù)據(jù)庫中提供了簡單的根據(jù)蛋白質(zhì)標記號的查詢服務。數(shù)據(jù)庫儲存于 http：//www.Proteome-NHTE.org.cn，及http：//www.Proteome-SBTCC.org.cn。 6.生物通路分析

12、結果：ArrayTrack軟件分析差異表達蛋白質(zhì)，結果顯示低惡性膀胱移行細胞癌中129個差異表達的蛋白定位于目前已知的生物通路，這些差異表達的基因主要屬于下列生物通路：氧化磷酸化、ECM受體相互作用、Toll-like受體通路、細胞通信、聚合黏附、核糖體、MAPK信號通路等。高惡性移行細胞癌中181個差異表達的蛋白定位于目前已知的生物通路，通路分析結果顯示，兩類癌中涉及的差異通路基本一致，但每個通路中發(fā)生改變的蛋白并不相同。結果提示腫瘤

13、發(fā)生發(fā)展過程中涉及多基因、多通路復雜的基因網(wǎng)絡異常；兩類癌存在不同的驅(qū)動機制。 結論： 1．本研究在國內(nèi)首次聯(lián)合應用激光捕獲顯微切割與蛋白質(zhì)組學技術成功構建了膀胱癌差異表達蛋白譜。在低惡性膀胱移行細胞癌與相應正常膀胱粘膜之間選出388個差異表達蛋白質(zhì)，其中包括305個特異表達于腫瘤細胞，83個特異表達于正常上皮細胞，說明膀胱癌發(fā)生發(fā)展過程中存在多蛋白質(zhì)表達異常，這些差異表達蛋白質(zhì)為膀胱癌分子機制研究提供了大量有價值的信息

14、。 2．在差異表達蛋白譜中挑取出2個差異蛋白TPD52，NHERF進行經(jīng)典的免疫蛋白印跡檢測，結果顯示與正常膀胱粘膜比較，TPD52，NHERF 水平在低惡性膀胱移形細胞癌中差異表達，而且這兩個蛋白均通過一個肽段鑒定，證實了聯(lián)合激光捕獲顯微切割與串聯(lián)質(zhì)譜進行表達譜研究的可靠性。應用免疫組化技術研究了TPD52 和 NHERF 在膀胱癌組織中的表達及臨床意義，結果顯示：TPD52和NHERF 在膀胱癌中表達陽性率明顯高于正常膀胱粘

15、膜中的表達陽性率，差異均有顯著意義(P<0．05)。膀胱癌組織中 TPD52的陽性表達隨著腫瘤病理分級的升高而增加(P<0．05)，而與浸潤深度無相關性(P>0．05)。NHERF的表達與浸潤深度、病理分級均不具相關性(P>0．05)。 3．循證分析的結果顯示：PI、MW 不能預測生物標記，尚需要發(fā)展其他方法來指導2DE蛋白質(zhì)組學技術中對差異表達蛋白質(zhì)的選擇性切膠；Shotgun策略不但擴大了蛋白質(zhì)的檢出范圍，同樣擴大了生物標記

16、的檢出；蛋白質(zhì)的基本理化描述，包括PI, MW，跨膜預測，GRAVY對生物標記的發(fā)現(xiàn)沒有預測意義；尚需要發(fā)展其他的生物信息學預測方法來預測為知蛋白成為生物標記的可能性。 4．對腫瘤蛋白質(zhì)表達譜的GO濃集/缺失表達分析對深入了解低惡性淺表膀胱移行細胞癌的細胞生物學、發(fā)生發(fā)展機制提供了理論依據(jù)，并根據(jù)PubMed文本信息挖掘揭示了傾向于在尿液中濃集表達的蛋白質(zhì)類別，為制備小型蛋白質(zhì)芯片從尿液中無創(chuàng)檢測腫瘤提供了理論依據(jù)，并進一步證實

17、了本實驗結果的可靠性。 5．按照國際蛋白質(zhì)組學研究慣例，在蛋白質(zhì)鑒定信息以及功能分析的基礎上，建立了開放數(shù)據(jù)庫，為蛋白質(zhì)信息交流和比對提供了平臺。GO分支術語以及蛋白質(zhì)列表均與歐洲生物信息學中心建立超鏈接。用戶可以在任何等級指定GO術語，或者選定列表中的蛋白質(zhì)，通過超鏈接獲得儲存于OuickGO(http：//www.ebi.ac.uk/ego/)的GO數(shù)據(jù)或者存放于歐洲生物信息學研究所數(shù)據(jù)庫(http://www.ebi.ac