細胞色素P450表氧化酶基因2J2抑制心肌肥厚的作用及其機制.pdf

1、花生四烯酸 (arachidonicacid，AA)在生物體內(nèi)的含量非常豐富，是機體內(nèi)許多重要的生物活性物質(zhì)的前體，間接影響著生物體內(nèi)許多重要的生物學功能。花生四烯酸主要結合于細胞膜內(nèi)側脂肪酸上，當受外界生理因素刺激時經(jīng)磷脂酶A2 水解即釋放到胞漿中?；ㄉ南┧峤?jīng)環(huán)氧化酶和脂氧化酶途徑代謝早已被廣泛研究和認識。80年代以來，科學家們發(fā)現(xiàn)了花生四烯酸的第三條代謝途徑，即花生四烯酸細胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)代

2、謝途徑，它在生物體內(nèi)的生物學及病理生理學意義逐漸被認識和重視。其中，細胞色素P450表氧化酶代謝花生四烯酸生成四種不同的環(huán)氧-二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoic acids，EETs)，分別為5,6-EET，8,9-EET，11,12-EET與14,15-EET。CYP表氧化酶主要包括2C和2J 兩類，其中在人類僅發(fā)現(xiàn)了2J2，其在心臟和血管內(nèi)皮細胞表達最豐富。我們和國外學者已有研究發(fā)現(xiàn)EETs在調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)

3、揮著重要作用，包括調(diào)節(jié)血壓、對心臟和血管內(nèi)皮細胞的保護及抗凋亡作用。
　　 心肌肥厚被認為是心力衰竭的發(fā)生與發(fā)展中的一個重要中間階段。心肌肥厚是心臟對工作負荷增加的一種代償性反應，盡管最初的肥厚反應對心臟是有益的，然而持久的心肌肥厚可以導致心力衰竭，而且是主要心血管事件包括缺血性心臟病、心律失常以及猝死的獨立危險因素。大量研究表明細胞色素P450表氧化酶-EETs系統(tǒng)在維護心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中具有重要的作用；增加體內(nèi)EETs的含量具

4、有明顯心血管系統(tǒng)的保護作用，同時可能具有抑制心肌肥厚的作用。而細胞色素P450表氧化酶基因在心肌肥厚以及心力衰竭的作用目前尚無報道。
　　 在本研究中，我們設想通過使心臟CYP2J2基因表達增加，導致EETs水平增加，在預防和逆轉心肌肥厚及心力衰竭的作用中具有重要的保護作用。因此，首先在體外研究外源性EETs和內(nèi)源性EETs對Ang II誘導的心肌細胞肥厚的影響以及可能的分子機制，然后，在Ang II 誘導的心肌肥厚模型中，研究

5、CYP2J2基因治療對心肌肥厚的影響以及可能的分子機制，旨在從整體動物水平和細胞水平明確CYP2J2-EETs系統(tǒng)是否能夠預防和逆轉心肌肥厚，進一步明確CYP2J2-EETs系統(tǒng)是否能夠延緩心力衰竭的進展。
　　 一、體外實驗：
　　 外源性EETs和內(nèi)源性EETs 抑制心肌細胞肥大的作用及其機制(一)實驗方法：
　　 1．H9C2細胞培養(yǎng)于含10％ FBS的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，當心肌細胞長至50％左右時，將

6、H9C2細胞同步化處理后分別進行了外源性EETs 干預和內(nèi)源性EETs 干預，1)外源性EETs 干預：將Ang II，EET 抑制劑14,15-EEZE，Lorsatan以及14,15-EET一起干預細胞48小時。2)內(nèi)源性EETs干預：在Ang II干預前，用FugeneHD 將質(zhì)粒pcDNA3.1-2J2和pcDNA3.1-GFP分別轉染進心肌細胞，同時在pcDNA3.1-2J2組加入CYP2J2 選擇性抑制劑C26，同樣干預48

7、 小時。
　　 2．將干預的細胞用PBS 洗后，用多聚甲醛進行固定，加封閉液封閉半小時，按1：
　　 200 比例加F-actin染料室溫染色1 小時后，再用洗脫液進行洗脫，加封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察細胞大小，拍照后用軟件計算細胞表面積。
　　 3．將干預后的細胞用Trizol 提取RNA和蛋白質(zhì)，將RNA 逆轉錄為cDNA后，用Real-time PCR分析7-MHC和ANP的相對量。用Bradford

8、法測量不同干預組的蛋白濃度后，比較各組之間的蛋白含量。
　　 4．經(jīng)過同步化處理的H9C2細胞，將EET，EGFR，PI3K以及PPAR:的抑制劑14,15-EEZE，AG1478，LY294002以及GW9662與H9C2細胞以及14,15-EET 共同孵育48 小時后，收集細胞上清液。將干預后的細胞，用三去污裂解液提取細胞蛋白質(zhì)，應用Western blot方法檢測P-EGFR，EGFR，PI3K，P-AKT，AKT，P-C

9、REB，CREB，ANP的表達。應用ELISA的方法檢測細胞上清液中ANP的含量和細胞內(nèi)cGMP的含量。
　　 5．經(jīng)過同步化處理的H9C2細胞，，隨后將Ang II和14,15-EET分別干預細胞，并在不同的培養(yǎng)空中添加遞增濃度的ANP 抗體與Ang II和14,15-EET 一起干預細胞48 小時，隨后對心肌細胞進行F-actin染色。
　　 6．H9C2細胞經(jīng)過同步化處理后，加入Ang II和14,15-EET分別

10、干預細胞，同時加入ANP受體抑制劑A71915和PKG抑制劑KT5823與14,15-EET共同孵育48 小時，隨后對心肌細胞進行F-actin染色。收集細胞總蛋白，并分別提取細胞胞漿和胞核蛋白，再用Western blot 檢測總的CnA7表達，以及NF-AT的核轉位變化。
　　 (二)實驗結果：
　　 1．F-actin 染色結果顯示，14,15-EET 明顯抑制了Ang II 誘導的心肌細胞肥大(P<0.05)；而

11、14,15-EEZE 阻斷了EET的保護作用(P<0.05)。轉染了質(zhì)粒pcDNA3.1-2J2 也顯著抑制了心肌細胞肥大，C26 完全阻斷了CYP2J2的作用(P<0.05)。此外，細胞蛋白含量也證實了EET和CYP2J2的抑制肥厚效應(P<0.05)。
　　 EET和CYP2J2 沒有抑制Ang II誘導的ANP的表達增加，反而增加了ANP的表達，但是EET和CYP2J2抑制了心肌肥厚另外一個標記物7-MHC的表達(P<0.

12、05)。
　　 2．Western blot 檢測結果顯示，AG1478和LY294002 阻斷了14,15-EET 激活心肌細胞ANP的表達，還發(fā)現(xiàn)14,15-EET激活了EGFR、PI3K/AKT、CREB，提示EETs可能通過激活EGFR，PI3K/AKT，CREB信號通路上調(diào)ANP的表達(P<0.05)。ELISA檢測結果也顯示，14,15-EET 促進心肌細胞分泌ANP，使胞漿內(nèi)cGMP的含量增加 (P<0.05)。<

13、br>　　 3．在添加了不同濃度的ANP 抗體進行干預的實驗結果顯示，ANP 抗體濃度依賴性地阻斷了EET的抗心肌細胞肥厚效應(P<0.05)。
　　 4．在添加了ANP 受體阻斷劑和PKG抑制劑干預的實驗結果顯示，EET的抗心肌細胞肥厚效應被ANP受體阻斷劑和PKG抑制劑顯著阻斷了(P<0.05)。同時，EETs 抑制了CnA7表達以及NF-AT的向核內(nèi)轉位，但是其效應被ANP受體阻斷劑和PKG抑制劑顯著阻斷了(P<0.05

14、)。
　　 二、體內(nèi)實驗：
　　 P450表氧化酶基因2J2 過表達抑制大鼠心肌肥厚的作用及其機制（一）實驗方法：
　　 1．實驗動物適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為6組，每組6只SD大鼠，分別為：對照組注射生理鹽水，pcDNA3.1組注射pcDNA3.1，pcDNA3.1-2J2組注射pcDNA3.1-2J2，Ang II組注射生理鹽水，Ang II+pcDNA3.1組注射pcDNA3.1，Ang II+pcDNA3

15、.1-2J2組注射pcDNA3.1-2J2。實驗開始前，采用ADI無創(chuàng)血壓計記錄尾動脈基礎血壓值。
　　 2．真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1與pcDNA3.1-2J2的大量提取和純化（應用堿裂解法提取，硅藻土純化法純化）；目的質(zhì)粒pcDNA3.1-2J2與對照質(zhì)粒pcDNA3.1經(jīng)尾靜脈注射導入動物體內(nèi)，每種質(zhì)粒注射的劑量是5mg/kg體重，空白對照組注入相同體積的生理鹽水。在注射質(zhì)粒的同時，切開背部皮膚，擴張皮下組織間隙，將含有

16、Ang II的壓力調(diào)控微泵(Alzet 2002)埋入動物皮下，清潔切口后迅速縫合切口。Ang II的劑量按照500ng/kg/min的速度釋放2周時間。在基因及微泵導入后的第3、7、10、14天，采用ADI無創(chuàng)血壓計分別記錄尾動脈血壓。
　　 3．質(zhì)粒注射及微泵植入2周后，留取24小時尿標本，在戊巴比妥鈉麻醉下進行心臟超聲檢查。處死動物前，動物稱重，麻醉后用Millar導管經(jīng)右頸動脈插入左心室記錄心臟血流動力學指標，隨后留取血

17、液標本；取心臟，測量大小后拍照記錄，并稱重計算心臟體重比；心臟，主動脈，肝臟，腎臟等組織放入液氮冷凍后轉入-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆茫糠中呐K組織標本放入甲醛溶液中固定，脫水浸臘石蠟包埋后室溫保存?zhèn)溆谩?br>　　 4．應用ELISA的方法檢測動物心臟14,15-DHET和尿cGMP的含量，血清ANP的含量；
　　 應用Western blot的方法檢測實驗動物心臟CYP2J2和ANP的表達，以及P38MAPK、ERK的磷酸化表

18、達，CnA7的表達、NF-AT的核轉位表達情況；對心肌組織切片進行HE染色和天狼星紅染色，計算心肌細胞直徑大小和膠原沉積情況。
　　 （二）實驗結果：
　　 1．血壓測量結果顯示，與正常對照組比較，Ang II導致了動物血壓明顯升高，而質(zhì)粒pcDNA3.1-2J2 則明顯抑制了Ang II 誘導的血壓升高(P<0.05)。
　　 2．注射pcDNA3.1-2J2的大鼠心臟組織的CYP2J2表達顯著增加；ELISA

19、檢測結果顯示，pcDNA3.1-2J2和Ang II+pcDNA-2J2組心臟14,15-EET的含量明顯高于對照組(P<0.05)。
　　 3．心臟超聲檢查結果顯示，Ang II使心臟室間隔和左室后壁明顯增厚，pcDNA3.1-2J2抑制了室間隔和左室后壁的增厚(P<0.05)。但是Ang II和pcDNA3.1-2J2 對射血分數(shù)(EF)和短軸縮窄率(FS)均沒有明顯影響。Millar 導管記錄的血流動力學結果顯示，結果顯示

20、Ang II使左室舒張末壓(LVEDP)明顯升高，使左室壓力最大下降速度(dp/dt min)顯著降低；pcDNA3.1-2J2 降低了LVEDP，增加了dp/dt min (P<0.05)，但是心率(HR)，左室收縮末壓(LVESP)，心輸出量(CO)和左室壓力最大上升速率(dp/dt max)均未出現(xiàn)明顯改變。
　　 4．Ang II顯著增加了心臟體重比，pcDNA3.1-2J2 抑制了心臟體重比的增加(P<0.05)。

21、r>　　 心臟的H&E 染色顯示pcDNA3.1-2J2 顯著抑制了Ang II 導致心肌細胞肥大(P<0.05)，天狼星紅染色顯示pcDNA3.1-2J2 顯著改善了Ang II導致的心臟膠原沉積(P<0.05)。
　　 5．pcDNA3.1-2J2，Ang II，Ang II+pcDNA3.1，Ang II+pcDNA3.1-2J2組動物的心臟ANP的表達和分泌均是增加的(P<0.05)，同時尿cGMP 排泄量也是增加的(

22、P<0.05)。
　　 6．Western blot 檢測結果顯示，與對照組比較，Ang II組與 Ang II+pcDNA3.1組心肌組織中P-ERK，CnA7，核內(nèi)NF-AT的表達水平顯著增加(P<0.05)，pcDNA3.1-2J2顯著抑制了心肌中P-ERK，CnA7，核內(nèi)NF-AT的表達水平(P<0.05)，而對心肌中P-p38的表達水平無明顯影響。
　　 結論：
　　 1．外源性EETs和內(nèi)源性EETs

23、 均能有效地抑制Ang II導致的心肌細胞肥大，可能是通過促進ANP的表達和分泌達到抗心肌細胞肥大的作用。
　　 2．EETs 促進ANP表達和分泌的可能機制是通過激活EGFR/PI3K/AKT/CREB信號通路。
　　 3．EETs 抑制心肌細胞肥大的可能機制是：EETs 激活ANP，ANP與其受體結合后，激活下游的第二信使cGMP，cGMP激活PKG，進而抑制CnA7的表達以及NF-AT的核內(nèi)轉位。
　　 4

24、．在動物體內(nèi)，CYP2J2基因在心臟的過表達明顯抑制了Ang II導致的心肌肥厚和心肌重構，其可能機制也是通過上調(diào)ANP的表達，抑制CnA7的表達和NF-AT的核內(nèi)轉位，以及抑制ERK的磷酸化。
　　 5．CYP2J2-EETs系統(tǒng)通過上調(diào)ANP水平，抑制CnA7的表達和NF-AT的核內(nèi)轉位，最終抑制心肌肥厚和心肌重構，延緩心力衰竭的進展。本實驗的研究結果為將來研究心肌肥厚和心力衰竭的防治新策略，尋找新的藥物作用靶點，開發(fā)新的治