細(xì)胞色素P450表氧化酶基因2J2抑制心肌肥厚的作用及其機(jī)制.pdf

1、花生四烯酸 (arachidonicacid，AA)在生物體內(nèi)的含量非常豐富，是機(jī)體內(nèi)許多重要的生物活性物質(zhì)的前體，間接影響著生物體內(nèi)許多重要的生物學(xué)功能。花生四烯酸主要結(jié)合于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)脂肪酸上，當(dāng)受外界生理因素刺激時(shí)經(jīng)磷脂酶A2 水解即釋放到胞漿中?；ㄉ南┧峤?jīng)環(huán)氧化酶和脂氧化酶途徑代謝早已被廣泛研究和認(rèn)識(shí)。80年代以來(lái)，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了花生四烯酸的第三條代謝途徑，即花生四烯酸細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)代

2、謝途徑，它在生物體內(nèi)的生物學(xué)及病理生理學(xué)意義逐漸被認(rèn)識(shí)和重視。其中，細(xì)胞色素P450表氧化酶代謝花生四烯酸生成四種不同的環(huán)氧-二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoic acids，EETs)，分別為5,6-EET，8,9-EET，11,12-EET與14,15-EET。CYP表氧化酶主要包括2C和2J 兩類(lèi)，其中在人類(lèi)僅發(fā)現(xiàn)了2J2，其在心臟和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)最豐富。我們和國(guó)外學(xué)者已有研究發(fā)現(xiàn)EETs在調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)

3、揮著重要作用，包括調(diào)節(jié)血壓、對(duì)心臟和血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)及抗凋亡作用。
　　 心肌肥厚被認(rèn)為是心力衰竭的發(fā)生與發(fā)展中的一個(gè)重要中間階段。心肌肥厚是心臟對(duì)工作負(fù)荷增加的一種代償性反應(yīng)，盡管最初的肥厚反應(yīng)對(duì)心臟是有益的，然而持久的心肌肥厚可以導(dǎo)致心力衰竭，而且是主要心血管事件包括缺血性心臟病、心律失常以及猝死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。大量研究表明細(xì)胞色素P450表氧化酶-EETs系統(tǒng)在維護(hù)心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中具有重要的作用；增加體內(nèi)EETs的含量具

4、有明顯心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用，同時(shí)可能具有抑制心肌肥厚的作用。而細(xì)胞色素P450表氧化酶基因在心肌肥厚以及心力衰竭的作用目前尚無(wú)報(bào)道。
　　 在本研究中，我們?cè)O(shè)想通過(guò)使心臟CYP2J2基因表達(dá)增加，導(dǎo)致EETs水平增加，在預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌肥厚及心力衰竭的作用中具有重要的保護(hù)作用。因此，首先在體外研究外源性EETs和內(nèi)源性EETs對(duì)Ang II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥厚的影響以及可能的分子機(jī)制，然后，在Ang II 誘導(dǎo)的心肌肥厚模型中，研究

5、CYP2J2基因治療對(duì)心肌肥厚的影響以及可能的分子機(jī)制，旨在從整體動(dòng)物水平和細(xì)胞水平明確CYP2J2-EETs系統(tǒng)是否能夠預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌肥厚，進(jìn)一步明確CYP2J2-EETs系統(tǒng)是否能夠延緩心力衰竭的進(jìn)展。
　　 一、體外實(shí)驗(yàn)：
　　 外源性EETs和內(nèi)源性EETs 抑制心肌細(xì)胞肥大的作用及其機(jī)制(一)實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1．H9C2細(xì)胞培養(yǎng)于含10％ FBS的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，當(dāng)心肌細(xì)胞長(zhǎng)至50％左右時(shí)，將

6、H9C2細(xì)胞同步化處理后分別進(jìn)行了外源性EETs 干預(yù)和內(nèi)源性EETs 干預(yù)，1)外源性EETs 干預(yù)：將Ang II，EET 抑制劑14,15-EEZE，Lorsatan以及14,15-EET一起干預(yù)細(xì)胞48小時(shí)。2)內(nèi)源性EETs干預(yù)：在Ang II干預(yù)前，用FugeneHD 將質(zhì)粒pcDNA3.1-2J2和pcDNA3.1-GFP分別轉(zhuǎn)染進(jìn)心肌細(xì)胞，同時(shí)在pcDNA3.1-2J2組加入CYP2J2 選擇性抑制劑C26，同樣干預(yù)48

7、 小時(shí)。
　　 2．將干預(yù)的細(xì)胞用PBS 洗后，用多聚甲醛進(jìn)行固定，加封閉液封閉半小時(shí)，按1：
　　 200 比例加F-actin染料室溫染色1 小時(shí)后，再用洗脫液進(jìn)行洗脫，加封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞大小，拍照后用軟件計(jì)算細(xì)胞表面積。
　　 3．將干預(yù)后的細(xì)胞用Trizol 提取RNA和蛋白質(zhì)，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，用Real-time PCR分析7-MHC和ANP的相對(duì)量。用Bradford

8、法測(cè)量不同干預(yù)組的蛋白濃度后，比較各組之間的蛋白含量。
　　 4．經(jīng)過(guò)同步化處理的H9C2細(xì)胞，將EET，EGFR，PI3K以及PPAR:的抑制劑14,15-EEZE，AG1478，LY294002以及GW9662與H9C2細(xì)胞以及14,15-EET 共同孵育48 小時(shí)后，收集細(xì)胞上清液。將干預(yù)后的細(xì)胞，用三去污裂解液提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)P-EGFR，EGFR，PI3K，P-AKT，AKT，P-C

9、REB，CREB，ANP的表達(dá)。應(yīng)用ELISA的方法檢測(cè)細(xì)胞上清液中ANP的含量和細(xì)胞內(nèi)cGMP的含量。
　　 5．經(jīng)過(guò)同步化處理的H9C2細(xì)胞，，隨后將Ang II和14,15-EET分別干預(yù)細(xì)胞，并在不同的培養(yǎng)空中添加遞增濃度的ANP 抗體與Ang II和14,15-EET 一起干預(yù)細(xì)胞48 小時(shí)，隨后對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行F-actin染色。
　　 6．H9C2細(xì)胞經(jīng)過(guò)同步化處理后，加入Ang II和14,15-EET分別

10、干預(yù)細(xì)胞，同時(shí)加入ANP受體抑制劑A71915和PKG抑制劑KT5823與14,15-EET共同孵育48 小時(shí)，隨后對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行F-actin染色。收集細(xì)胞總蛋白，并分別提取細(xì)胞胞漿和胞核蛋白，再用Western blot 檢測(cè)總的CnA7表達(dá)，以及NF-AT的核轉(zhuǎn)位變化。
　　 (二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1．F-actin 染色結(jié)果顯示，14,15-EET 明顯抑制了Ang II 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大(P<0.05)；而

11、14,15-EEZE 阻斷了EET的保護(hù)作用(P<0.05)。轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒pcDNA3.1-2J2 也顯著抑制了心肌細(xì)胞肥大，C26 完全阻斷了CYP2J2的作用(P<0.05)。此外，細(xì)胞蛋白含量也證實(shí)了EET和CYP2J2的抑制肥厚效應(yīng)(P<0.05)。
　　 EET和CYP2J2 沒(méi)有抑制Ang II誘導(dǎo)的ANP的表達(dá)增加，反而增加了ANP的表達(dá)，但是EET和CYP2J2抑制了心肌肥厚另外一個(gè)標(biāo)記物7-MHC的表達(dá)(P<0.

12、05)。
　　 2．Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，AG1478和LY294002 阻斷了14,15-EET 激活心肌細(xì)胞ANP的表達(dá)，還發(fā)現(xiàn)14,15-EET激活了EGFR、PI3K/AKT、CREB，提示EETs可能通過(guò)激活EGFR，PI3K/AKT，CREB信號(hào)通路上調(diào)ANP的表達(dá)(P<0.05)。ELISA檢測(cè)結(jié)果也顯示，14,15-EET 促進(jìn)心肌細(xì)胞分泌ANP，使胞漿內(nèi)cGMP的含量增加 (P<0.05)。<

13、br>　　 3．在添加了不同濃度的ANP 抗體進(jìn)行干預(yù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ANP 抗體濃度依賴(lài)性地阻斷了EET的抗心肌細(xì)胞肥厚效應(yīng)(P<0.05)。
　　 4．在添加了ANP 受體阻斷劑和PKG抑制劑干預(yù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EET的抗心肌細(xì)胞肥厚效應(yīng)被ANP受體阻斷劑和PKG抑制劑顯著阻斷了(P<0.05)。同時(shí)，EETs 抑制了CnA7表達(dá)以及NF-AT的向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，但是其效應(yīng)被ANP受體阻斷劑和PKG抑制劑顯著阻斷了(P<0.05

14、)。
　　 二、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：
　　 P450表氧化酶基因2J2 過(guò)表達(dá)抑制大鼠心肌肥厚的作用及其機(jī)制（一）實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為6組，每組6只SD大鼠，分別為：對(duì)照組注射生理鹽水，pcDNA3.1組注射pcDNA3.1，pcDNA3.1-2J2組注射pcDNA3.1-2J2，Ang II組注射生理鹽水，Ang II+pcDNA3.1組注射pcDNA3.1，Ang II+pcDNA3

15、.1-2J2組注射pcDNA3.1-2J2。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，采用ADI無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)記錄尾動(dòng)脈基礎(chǔ)血壓值。
　　 2．真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1與pcDNA3.1-2J2的大量提取和純化（應(yīng)用堿裂解法提取，硅藻土純化法純化）；目的質(zhì)粒pcDNA3.1-2J2與對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1經(jīng)尾靜脈注射導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，每種質(zhì)粒注射的劑量是5mg/kg體重，空白對(duì)照組注入相同體積的生理鹽水。在注射質(zhì)粒的同時(shí)，切開(kāi)背部皮膚，擴(kuò)張皮下組織間隙，將含有

16、Ang II的壓力調(diào)控微泵(Alzet 2002)埋入動(dòng)物皮下，清潔切口后迅速縫合切口。Ang II的劑量按照500ng/kg/min的速度釋放2周時(shí)間。在基因及微泵導(dǎo)入后的第3、7、10、14天，采用ADI無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)分別記錄尾動(dòng)脈血壓。
　　 3．質(zhì)粒注射及微泵植入2周后，留取24小時(shí)尿標(biāo)本，在戊巴比妥鈉麻醉下進(jìn)行心臟超聲檢查。處死動(dòng)物前，動(dòng)物稱(chēng)重，麻醉后用Millar導(dǎo)管經(jīng)右頸動(dòng)脈插入左心室記錄心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，隨后留取血

17、液標(biāo)本；取心臟，測(cè)量大小后拍照記錄，并稱(chēng)重計(jì)算心臟體重比；心臟，主動(dòng)脈，肝臟，腎臟等組織放入液氮冷凍后轉(zhuǎn)入-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?，部分心臟組織標(biāo)本放入甲醛溶液中固定，脫水浸臘石蠟包埋后室溫保存?zhèn)溆谩?br>　　 4．應(yīng)用ELISA的方法檢測(cè)動(dòng)物心臟14,15-DHET和尿cGMP的含量，血清ANP的含量；
　　 應(yīng)用Western blot的方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心臟CYP2J2和ANP的表達(dá)，以及P38MAPK、ERK的磷酸化表

18、達(dá)，CnA7的表達(dá)、NF-AT的核轉(zhuǎn)位表達(dá)情況；對(duì)心肌組織切片進(jìn)行HE染色和天狼星紅染色，計(jì)算心肌細(xì)胞直徑大小和膠原沉積情況。
　　 （二）實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1．血壓測(cè)量結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，Ang II導(dǎo)致了動(dòng)物血壓明顯升高，而質(zhì)粒pcDNA3.1-2J2 則明顯抑制了Ang II 誘導(dǎo)的血壓升高(P<0.05)。
　　 2．注射pcDNA3.1-2J2的大鼠心臟組織的CYP2J2表達(dá)顯著增加；ELISA

19、檢測(cè)結(jié)果顯示，pcDNA3.1-2J2和Ang II+pcDNA-2J2組心臟14,15-EET的含量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。
　　 3．心臟超聲檢查結(jié)果顯示，Ang II使心臟室間隔和左室后壁明顯增厚，pcDNA3.1-2J2抑制了室間隔和左室后壁的增厚(P<0.05)。但是Ang II和pcDNA3.1-2J2 對(duì)射血分?jǐn)?shù)(EF)和短軸縮窄率(FS)均沒(méi)有明顯影響。Millar 導(dǎo)管記錄的血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，結(jié)果顯示

20、Ang II使左室舒張末壓(LVEDP)明顯升高，使左室壓力最大下降速度(dp/dt min)顯著降低；pcDNA3.1-2J2 降低了LVEDP，增加了dp/dt min (P<0.05)，但是心率(HR)，左室收縮末壓(LVESP)，心輸出量(CO)和左室壓力最大上升速率(dp/dt max)均未出現(xiàn)明顯改變。
　　 4．Ang II顯著增加了心臟體重比，pcDNA3.1-2J2 抑制了心臟體重比的增加(P<0.05)。

21、r>　　 心臟的H&E 染色顯示pcDNA3.1-2J2 顯著抑制了Ang II 導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大(P<0.05)，天狼星紅染色顯示pcDNA3.1-2J2 顯著改善了Ang II導(dǎo)致的心臟膠原沉積(P<0.05)。
　　 5．pcDNA3.1-2J2，Ang II，Ang II+pcDNA3.1，Ang II+pcDNA3.1-2J2組動(dòng)物的心臟ANP的表達(dá)和分泌均是增加的(P<0.05)，同時(shí)尿cGMP 排泄量也是增加的(

22、P<0.05)。
　　 6．Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Ang II組與 Ang II+pcDNA3.1組心肌組織中P-ERK，CnA7，核內(nèi)NF-AT的表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，pcDNA3.1-2J2顯著抑制了心肌中P-ERK，CnA7，核內(nèi)NF-AT的表達(dá)水平(P<0.05)，而對(duì)心肌中P-p38的表達(dá)水平無(wú)明顯影響。
　　 結(jié)論：
　　 1．外源性EETs和內(nèi)源性EETs

23、 均能有效地抑制Ang II導(dǎo)致的心肌細(xì)胞肥大，可能是通過(guò)促進(jìn)ANP的表達(dá)和分泌達(dá)到抗心肌細(xì)胞肥大的作用。
　　 2．EETs 促進(jìn)ANP表達(dá)和分泌的可能機(jī)制是通過(guò)激活EGFR/PI3K/AKT/CREB信號(hào)通路。
　　 3．EETs 抑制心肌細(xì)胞肥大的可能機(jī)制是：EETs 激活A(yù)NP，ANP與其受體結(jié)合后，激活下游的第二信使cGMP，cGMP激活PKG，進(jìn)而抑制CnA7的表達(dá)以及NF-AT的核內(nèi)轉(zhuǎn)位。
　　 4

24、．在動(dòng)物體內(nèi)，CYP2J2基因在心臟的過(guò)表達(dá)明顯抑制了Ang II導(dǎo)致的心肌肥厚和心肌重構(gòu)，其可能機(jī)制也是通過(guò)上調(diào)ANP的表達(dá)，抑制CnA7的表達(dá)和NF-AT的核內(nèi)轉(zhuǎn)位，以及抑制ERK的磷酸化。
　　 5．CYP2J2-EETs系統(tǒng)通過(guò)上調(diào)ANP水平，抑制CnA7的表達(dá)和NF-AT的核內(nèi)轉(zhuǎn)位，最終抑制心肌肥厚和心肌重構(gòu)，延緩心力衰竭的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果為將來(lái)研究心肌肥厚和心力衰竭的防治新策略，尋找新的藥物作用靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)新的治