細(xì)胞色素P450表氧化酶2J2基因過表達(dá)對(duì)KKAy糖尿病小鼠心肌纖維化的治療作用及其機(jī)制.pdf

1、研究背景和目的：糖尿病心肌病(diabeticcardiomyopathy,DCM)是糖尿病引起的心肌代謝紊亂和心臟微血管病變所致的心臟病,是糖尿病患者主要心臟并發(fā)癥之一。主要的病理變化表現(xiàn)為:心肌細(xì)胞肥大;心肌間質(zhì)膠原纖維沉積和纖維化。由于這些病理過程的發(fā)展,早期通常表現(xiàn)為舒張功能障礙,晚期收縮期充血性心力衰竭。然而,這些病理生理變化的主要原因是心肌纖維化。隨著糖尿病發(fā)病率的逐年升高,糖尿病心肌病也表現(xiàn)為高發(fā)病率和高致死率。
　

2、　細(xì)胞色素P450(CytochromeP450,CYP)能代謝花生四烯酸(AA)產(chǎn)生四種不同小分子化合物,表氧—二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoicacids,簡(jiǎn)稱EETs,分別為5,6-EET,8,9-EET,11,12-EET,14,15-EET),后者在體內(nèi)被可溶性表氧化物水解酶(solubleepoxidehydrolase,sEH)代謝生成DHETs(dihydroxyeicosatrienoicacids)

3、,CYP表氧化酶和EETs構(gòu)成一個(gè)完整的系統(tǒng)發(fā)揮生理作用。目前已知EETs通過IR/IRS1和PI3K/AKT等多條信號(hào)通路改善胰島素抵抗;EETS可以抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的活化而發(fā)揮抗炎作用;EETs還可以抗氧化應(yīng)激、抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等等作用。另外,CYP表氧化酶包括2C和2J兩類,2C基因在人類有2個(gè)克隆(2C8,2C9),在人體內(nèi)有廣泛分布,尤其在肝臟最豐富;2J已知的8個(gè)克隆中只有2J2在人類基因組中發(fā)現(xiàn)。CYP2J2主要在

4、人類心臟、血管內(nèi)皮細(xì)胞、胰腺和腎臟豐富表達(dá)。由此,我們就設(shè)想在心臟高表達(dá)的CYP2J2-EETs系統(tǒng)對(duì)糖尿病心肌病有沒有作用?如果有效應(yīng),那么它的分子機(jī)制又是什么呢?帶著這些科學(xué)假設(shè)確立了本課題的研究目的:1)、研究細(xì)胞色素P450表氧化酶2J2基因過表達(dá)對(duì)糖尿病心肌纖維化的作用;2)細(xì)胞色素P450表氧化酶2J2基因過表達(dá)對(duì)糖尿病心肌纖維化的作用的分子機(jī)制。
　　方法：體內(nèi)試驗(yàn):實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分六組,一組C57BL/6為糖尿病陰性對(duì)

5、照組,再將KKAy糖尿病小鼠分為五組,一組鹽水組,每?jī)商旃辔干睇}水,余下四組分別用rAAV-GFP、rAAV-CYP2J2、1471(sEH抑制劑)、rAAV-CYP2J2+1471干預(yù)。干預(yù)16周后,小鼠做心臟超聲檢查,再做高胰島素正常血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)。處死小鼠留取組織血漿和尿液,取心肌組織標(biāo)本做飽和苦味酸天狼星紅染色、免疫組化、免疫熒光染色,取凍存心肌組織標(biāo)本做Westernblot,應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)血漿IL-10、TGF-β的

6、含量和尿液中DHET的含量。體外試驗(yàn):用高糖(25mM)和14,15-EET干預(yù)NIH3T3細(xì)胞系,Westernblot檢測(cè)MMP2;用高糖(25mM)和14,15-EET干預(yù)RAW264.7細(xì)胞系,做劃痕實(shí)驗(yàn),ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)基里TGF-β的含量;用traswell小室共培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞系和NIH3T3細(xì)胞系,高糖(25mM)和14,15-EET干預(yù),免疫熒光檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞的遷移和NIH3T3細(xì)胞Collag

7、enI的分泌量,Westernblot檢測(cè)MCP1的表達(dá);提取SD乳鼠原代心肌成纖維細(xì)胞,用TGF-β和14,15-EET干預(yù),Westernblot和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)α-SMA的表達(dá)量。
　　結(jié)果：體內(nèi)試驗(yàn):心臟超聲結(jié)果顯示rAAV-CYP2J2、1471、rAAV-CYP2J2+1471組與KKAy-Saline組和rAAV-GFP組相比較IVS和LVPW兩項(xiàng)指標(biāo)得到改善,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,rAAV-CYP2J2、1471、rA

8、AV-CYP2J2+1471三組與C57組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在高胰島素正常血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)里,rAAV-CYP2J2、1471、rAAV-CYP2J2+1471和C57組的葡萄糖輸注速率和葡萄糖攝取率都較KKAy-Saline和rAAV-GFP多,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rAAV-CYP2J2、1471、rAAV-CYP2J2+1471、C57組和KKAy-Saline、rAAV-GFP組比較,飽和苦味酸天狼星紅染色顯示膠原的分泌量、免疫組化檢測(cè)顯

9、示CollagenI的分泌量、免疫熒光顯示的表達(dá)F4/80的細(xì)胞的量都有差別,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但是免疫組化檢測(cè)顯示CollagenIII的分泌量無差別。rAAV-CYP2J2、1471、rAAV-CYP2J2+1471、C57組分泌IL-10的量較KKAy-Saline組和rAAV-GFP組多,α分泌量較少。體外實(shí)驗(yàn):14,15-EET抑制了RAW264.7細(xì)胞由高糖誘導(dǎo)的遷移,抑制了RAW264.7細(xì)胞分泌TGF-β,抑制了TGF-β

10、誘導(dǎo)乳鼠原代成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
　　結(jié)論：CYP2J2表氧化酶基因及其代謝產(chǎn)物EETs抑制了KKAy糖尿病小鼠心肌纖維化,保護(hù)了心肌。其作用的機(jī)制是CYP2J2表氧化酶基因及其代謝產(chǎn)物EETs抑制了巨噬細(xì)胞向心肌遷移,減輕了炎癥反應(yīng),減少了TGF-β的分泌,從而抑制了成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,上調(diào)了MMP2的表達(dá),較少了CollagenI的分泌和細(xì)胞外基質(zhì)的形成,抑制了心肌纖維化。本課題提出EETs是防治糖尿病心肌