羅非魚Foxp3表達(dá)細(xì)胞及其在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊膜炎(EAE)中的作用.pdf

1、在哺乳類，大量研究表明，F(xiàn)oxp3是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatoryT cells，Tr)發(fā)生、發(fā)育及發(fā)揮生物學(xué)活性的關(guān)鍵因素，在誘導(dǎo)和維持免疫耐受及免疫抑制功能中具有決定性作用。一直以來，F(xiàn)oxp3被認(rèn)為限制性表達(dá)于CD4+CD25+Tr細(xì)胞中，但最近研究顯示，在非淋巴組織如乳房、肺、前列腺等上皮細(xì)胞及多種非血源性腫瘤細(xì)胞均可檢測到Foxp3的表達(dá)，從而表明，F(xiàn)oxp3除具有免疫調(diào)節(jié)功能外，可能在腫瘤的發(fā)生及演

2、化等方面具有廣泛的生物學(xué)功能。
　　硬骨魚類擁有與哺乳動物類似的T、B淋巴細(xì)胞，其抗原受體通過與哺乳動物類似的機(jī)制進(jìn)行基因片段的隨機(jī)組合、連接及突變產(chǎn)生。理論上，硬骨魚類也能產(chǎn)生大量自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞，但是否具有與哺乳動物類似的功能性免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞及其分子如Foxp3，目前尚不明了。迄今，已相繼從斑馬魚、虹鱒、大西洋鮭魚、河豚、羅非魚分離鑒定了Foxp3同源分子，但主要局限于mRNA水平的研究。硬骨魚類Foxp3是否具有與哺乳類類似

3、的細(xì)胞表達(dá)模式，目前尚未見報(bào)道。在前期研究中，我們從羅非魚(在本研究中，如未特殊說明，研究用的羅非魚均指尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)）分離并鑒定了Foxp3，并對其特異性片段（s-ntFoxp3）進(jìn)行了原核表達(dá)。基于此，本研究通過進(jìn)一步純化s-ntFoxp3重組蛋白，制備了抗羅非魚Foxp3兔源多克隆抗體(α Foxp3)，通過SDS-PAGE、Westernblot檢測其特異性，并通過免疫組化、流式細(xì)胞儀等

4、對其細(xì)胞表達(dá)模式進(jìn)行深入研究;另一方面，通過自身腦抗原免疫，構(gòu)建羅非魚實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊膜炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）模型，檢查Foxp3在EAE發(fā)生、發(fā)展過程中不同組織的表達(dá)變化情況，以期對其生物學(xué)作用進(jìn)行探討。主要研究結(jié)果如下:
　　1) SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，獲得的純化重組蛋白s-ntFoxp3分子量大小與預(yù)期相符，Western blottin

5、g檢測表明，在胸腺、脾、頭腎、腸、腎、胃、鰓中均見與預(yù)測大?。s44 kD）相符的明顯條帶，而在肌肉組織中未見陽性條帶，此結(jié)果與RT-PCR的結(jié)果相吻合，從而表明，α Foxp3具有較強(qiáng)的特異性。
　　2)免疫組化結(jié)果顯示，在體外分離的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中，F(xiàn)oxp3表達(dá)于部分淋巴樣細(xì)胞，并主要定位于細(xì)胞核;流式細(xì)胞儀分析表明，正常成年羅非魚PBMC中Foxp3+細(xì)胞所占百分率為5.7±2.0％(n=5);有絲分裂原植物

6、血凝素(PHA)體外刺激PBMC6、12和24小時(shí)后，PBMC中Foxp3+細(xì)胞頻率分別為21.9、19.1、7.86％，而未刺激組分別為7.38、6.47、2.70％。
　　3)在免疫相關(guān)組織如胸腺、脾、頭腎等，F(xiàn)oxp3主要表達(dá)于血源性淋巴樣細(xì)胞;在非淋巴組織胃中，在非血源性的黏膜上皮細(xì)胞觀察到Foxp3的陽性表達(dá)。
　　4)用羅非魚腦組織勻漿液與弗氏不完全佐劑充分乳化后，腹腔注射免疫羅非魚，不同時(shí)間點(diǎn)觀察羅非魚行為、體

7、重變化，結(jié)果顯示，免疫后第12d左右，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組魚行動減緩，反應(yīng)遲鈍、攝食量減少且體重增加量明顯降低;HE染色觀察腦組織、腎、腸、肝的病理變化，結(jié)果顯示，免疫后第1、3、6、7、9d實(shí)驗(yàn)組魚腦組織未見明顯病理變化，第12d后，實(shí)驗(yàn)組魚腦組織出現(xiàn)了類似于哺乳動物EAE的典型病理特征，即淋巴細(xì)胞浸潤、腦膜增厚、血管袖套樣等。此外，其他免疫相關(guān)組織也觀察到不同程度的病理變化，主要為充血和淋巴細(xì)胞浸潤。上述結(jié)果顯示，通過腦抗原的自身免

8、疫后羅非魚出現(xiàn)了自身免疫性疾病，從而表明羅非魚EAE模型構(gòu)建成功。
　　5)羅非魚腦組織自身抗原免疫后，分離不同時(shí)間點(diǎn)的PBMC，流式細(xì)胞儀檢測Foxp3+細(xì)胞頻率，結(jié)果顯示，免疫后第1-12 d，PBMC中Foxp3+細(xì)胞頻率顯著升高，第1、12d分別為63.6％、16.2％，而對照組分別為13.5％、7.98％，第15d開始，實(shí)驗(yàn)組PBMC中Foxp3+細(xì)胞頻率明顯低于對照組，第13、15、18d，PBMC中Foxp3+細(xì)胞頻

9、率分別為8％、3.34％、2.78％，對照組分別為，7.05％、5.37％、5.93％; real-timePCR及免疫組化分別檢測免疫后不同時(shí)間點(diǎn)脾、頭腎、腎中foxp3 mRNA及蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，第12d前各組織Foxp3的表達(dá)均明顯上調(diào)，第15 d Foxp3的表達(dá)顯著減少，此結(jié)果與流式細(xì)胞儀結(jié)果一致。從而表明，在低等脊椎動物羅非魚中，F(xiàn)oxp3的表達(dá)與自身免疫性疾病EAE的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　本研究一方面成功制