淫羊藿苷對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞及軸突的影響.pdf

1、【目的】：
　　中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘病變是多發(fā)性硬化（multiple sclerosis,MS）的主要病理特點，近年有關(guān)MS的星形膠質(zhì)細(xì)胞異常及軸突損害才逐步受到重視。我們的前期研究證實淫羊藿苷（ICA）可通過影響炎性細(xì)胞因子、HPA軸途徑調(diào)節(jié)炎性免疫機(jī)制而發(fā)揮對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠癥狀緩解及髓鞘保護(hù)作用。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，繼續(xù)采用以復(fù)發(fā)緩解型為特征的雌性C57BL/6 EAE小鼠模型為研究對象，通

2、過觀察治療前后各組間小鼠體重、神經(jīng)功能評分變化以及腦胼胝體切片GFAP（單標(biāo)）、NF200+β-APP（雙標(biāo)）免疫熒光染色變化，探討EAE小鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞異常和軸突損害，并研究ICA對其影響，揭示ICA對EAE是否具有非炎性神經(jīng)保護(hù)作用。
　　【方法】：
　　第一部分：
　　選取SPF級65只7-9周齡C57BL/6雌性小鼠，15只作為正常對照組，50只用于造模。將小鼠麻醉后將油包水狀態(tài)的MOG35-55抗原乳劑按每

3、只小鼠300ug的劑量皮下注射接種于小鼠脊柱兩側(cè)皮下（分四個部位注射），在接種后當(dāng)天及48小時后腹腔注射500ng百日咳毒素，初次免疫后第7天再次加強(qiáng)免疫1次。免疫后動態(tài)觀察小鼠是否出現(xiàn)神經(jīng)功能癥狀并對其神經(jīng)功能損害進(jìn)行評分。在小鼠疾病高峰期隨機(jī)抽取3只EAE小鼠及3只正常小鼠處死，取脊髓腰膨大用于HE染色，光鏡下觀察脊髓組織學(xué)變化，確定造模是否成功。
　　第二部分：
　　將造模成功后的EAE小鼠按評分相當(dāng)?shù)脑瓌t隨機(jī)分配到3

4、組內(nèi)，分別為雌激素組（陽性對照組）、ICA組、模型對照組，加上正常對照組（空白對照組），共4組，分別給予己烯雌酚0.2mg/kg.d、ICA300mg/kg.d、等容量0.5％羧甲基纖維素鈉、等容量0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃，連續(xù)給藥5天，給藥后第6天取材，以多聚甲醛心臟灌注取腦組織，經(jīng)后固定，蔗糖脫水后進(jìn)行冰凍切片分別進(jìn)行熒光染色：①GFAP（星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志）熒光單標(biāo)染色：根據(jù)免疫熒光染色步驟分別加入一抗GFAP，帶紅色熒光的二抗C

5、y3并封片，在熒光顯微鏡下，GFAP發(fā)紅色熒光；②NF200（軸突標(biāo)志）+β-APP（軸突損害標(biāo)志）熒光雙標(biāo)染色：根據(jù)免疫熒光染色步驟加入一抗NF200、β-AP P，分別加入帶綠色熒光的二抗Alexa Fluor488、帶紅色熒光的二抗Cy3并封片，在熒光顯微鏡下，NF200發(fā)綠色熒光，β-APP發(fā)紅色熒光。將以上染色后的切片在40×物鏡熒光顯微鏡下觀察并拍攝照片。采用Image J軟件對GFAP、NF200+β-APP圖片進(jìn)行熒光強(qiáng)

6、度分析，采用SPSS Statistics17軟件行統(tǒng)計學(xué)分析，應(yīng)用Graph Pad Prism軟件進(jìn)行作圖。計量資料采用?x±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)趨勢變量采用Pearson相關(guān)分析。
　　【結(jié)果】：
　　第一部分：
　　小鼠于免疫后第13-15天開始發(fā)病，2-3天后達(dá)疾病高峰，以尾部無力為首發(fā)癥狀的小鼠占大部分，亦有少部分小鼠

7、以行走時平衡障礙發(fā)病，逐漸加重至肢體無力、肢體癱瘓。最高神經(jīng)功能評分達(dá)5分，正常對照組小鼠無明顯異常。對EAE小鼠脊髓切片HE染色可見大量淋巴細(xì)胞浸潤，以血管周圍顯著，呈“袖套樣”改變。而正常對照組未見病變。根據(jù)小鼠癥狀、神經(jīng)功能評分及HE染色組織學(xué)改變說明構(gòu)建EAE小鼠模型成功。
　　第二部分：
　　（1）小鼠體重變化：小鼠接受抗原刺激后，體重開始出現(xiàn)下降，隨著時間的推移，體重下降越來越明顯。給予治療后，雌激素組和ICA組

8、EAE小鼠體重有明顯增加（P<0.01），治療后各組與模型對照組比較，雌激素組和ICA組體重有明顯改善（P<0.01），雌激素組與ICA組比較無明顯差異（P>0.05）。
　?。?）小鼠神經(jīng)功能變化：雌激素組和ICA組EAE小鼠治療后神經(jīng)功能評分有明顯改善（P<0.05），治療后各組與模型對照組比較，雌激素組和ICA組神經(jīng)功能評分亦有明顯好轉(zhuǎn)（P<0.05），雌激素組與ICA組比較無明顯差異（P>0.05）。
　?。?）EA

9、E小鼠存在星形膠質(zhì)細(xì)胞異常及軸突損害：模型對照組GFAP（星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志）熒光強(qiáng)度比正常組顯著增高，同時細(xì)胞形態(tài)異常，數(shù)量增加，說明EAE小鼠存在星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增殖；模型對照組軸突（NF200標(biāo)記）密度較正常組明顯下降，說明EAE小鼠存在軸突損害。
　?。?）ICA對EAE小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響：正常組的星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞體較小，突起如細(xì)絲狀向周邊延伸，形態(tài)未見異常，GFAP（星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志）熒光強(qiáng)度低；模型對照組熒光強(qiáng)度比正

10、常組顯著增高（P<0.05），且其處于活化狀態(tài)，細(xì)胞形態(tài)異常，胞體增大且變得不規(guī)則，突起粗短；與模型對照組相比，雌激素組及ICA組熒光強(qiáng)度明顯降低（P<0.05），形態(tài)基本接近正常。雌激素組與ICA組比較無明顯差異（P>0.05）。
　　（5） ICA對EAE小鼠軸突的影響：模型對照組軸突（NF200標(biāo)記）密度較正常組明顯下降（P<0.01）；雌激素、ICA治療組軸突密度較模型對照組明顯增高，均具有統(tǒng)計學(xué)意義，其中ICA組增高更明

11、顯（P<0.01），雌激素組與ICA組之間未見明顯差異（P>0.05）。而在正常組未見損害軸突（β-APP標(biāo)記），模型對照組β-APP熒光強(qiáng)度最高，表明軸突損害最嚴(yán)重，與模型對照組比較，經(jīng)治療后雌激素組和ICA組β-APP熒光強(qiáng)度均有明顯下降（P<0.01），雌激素組與ICA組之間未見明顯差異（P>0.05）。
　　【結(jié)論】：
　　（1）EAE小鼠胼胝體內(nèi)存在星形膠質(zhì)細(xì)胞異常，表現(xiàn)為增殖活化狀態(tài)，細(xì)胞形態(tài)異常，數(shù)量增加；且同