活性維生素D3在小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肌炎的作用研究.pdf

1、特發(fā)性炎癥性肌病是一種具體原因尚不明確的累及肌肉為主的疾病，病理特征主要表現(xiàn)為受累肌肉或其他組織的變性壞死以及大量免疫細(xì)胞的異常浸潤,涉及到了細(xì)胞免疫和體液免疫以及其他非免疫因素和因子的活化以及參與。首選的主要治療藥物包括糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑；由于治療效果并不理想，且長時間的應(yīng)用伴隨較多甚至危重的副作用，因此需要積極探索確切的發(fā)病機(jī)制以及尋求治療效果較理想并且副作用較小的藥物。
　　維生素D3的主要活性形式是1,25(OH)2D

2、3，即骨化三醇。作為一種類固醇激素，其經(jīng)典的作用是通過鈣磷代謝的調(diào)節(jié)，從而維持機(jī)體骨骼的健康。近年來研究發(fā)現(xiàn)其具有神經(jīng)內(nèi)分泌激素作用，通過與細(xì)胞內(nèi)的維生素D受體（VDR）結(jié)合，可從多方面多途徑調(diào)節(jié)免疫功能和炎癥防御。研究發(fā)現(xiàn)其缺乏與多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。活性維生素D3還能影響多種效應(yīng)T細(xì)胞的功能：可抑制Th17細(xì)胞相關(guān)因子如IL-17和IL-6的表達(dá)；還可以誘導(dǎo)產(chǎn)生具有免疫抑制功能的Treg細(xì)胞，同時增加抗炎性細(xì)胞因子IL-

3、10和TGF-β的表達(dá)。
　　我們前期的研究顯示，改良實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肌炎模型(EAM)較好的模擬了多發(fā)性肌炎的病理特點(diǎn)；該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮谠炷ｉ_始到2周為小鼠肌炎的進(jìn)展期，炎癥程度在2周達(dá)到高峰后逐漸緩解；前期研究顯示，促炎性Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性Treg細(xì)胞的失衡及其相關(guān)的因子的變化與該疾病的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。
　　活性維生素D3對肌炎的發(fā)展過程是否有抑制作用，目前尚未有研究報道。
　　目的：
　　觀察活性維生素

4、D3對肌炎模型小鼠的進(jìn)展期和持續(xù)期是否有抑制作用；若有作用，探討活性維生素D3是否通過Th17和Treg細(xì)胞及其相關(guān)因子發(fā)揮作用；進(jìn)一步與甲強(qiáng)龍的作用效果進(jìn)行比較，為臨床特發(fā)性炎癥性肌病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)分為兩大組：2周處理組和4周處理組。2周處理組：BALB/c小鼠隨機(jī)分為5小組，每組5只，觀察14天。正常對照組未進(jìn)行任何處理；模型組采用EAM模型處理；活性維生素D3干預(yù)組造模同時給予活性維生素D

5、3腹腔注射；甲強(qiáng)龍干預(yù)組造模同時給予甲強(qiáng)龍腹腔注射；聯(lián)合干預(yù)組造模同時給予甲強(qiáng)龍和活性維生素D3腹腔注射。4周處理組：分組同上，干預(yù)時間從造模第15天開始，干預(yù)方法同上，28天時觀察。
　　每組小鼠均進(jìn)行一般狀況觀察、肌力評估和組織病理學(xué)評分；采用實(shí)時熒光定量PCR檢測各組小鼠肌肉、淋巴結(jié)和脾臟中Th17細(xì)胞相關(guān)因子IL-17、IL-6、IL-23和Treg細(xì)胞及其相關(guān)因子IL-10、TGF-β和Foxp3 mRNA的表達(dá)水平；采

6、用Luminex液相芯片技術(shù)檢測各組小鼠血清中相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-6和IL-23的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1．與模型組比較，三種干預(yù)小鼠的肌力和肌肉組織的炎癥程度（病理學(xué)分值）無論在2周或4周均有所改善。改善程度由弱到強(qiáng)順序是骨化三醇組、甲強(qiáng)龍組、聯(lián)合干預(yù)組。雖然2周聯(lián)合干預(yù)的小鼠肌力和病理學(xué)得分好于甲強(qiáng)龍組，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；但4周聯(lián)合干預(yù)的小鼠則顯著好于甲強(qiáng)龍組（P<0.05）。
　　

7、2．小鼠肌肉和淋巴結(jié)組織中各因子的 mRNA表達(dá)水平：與模型組相比，骨化三醇干預(yù)后，在2周和4周都可以減少Th17細(xì)胞相關(guān)因子IL-6、IL-17和IL-23的表達(dá),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；甲強(qiáng)龍和聯(lián)合干預(yù)后更加降低了上述因子的表達(dá)，但兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。與模型組相比，在2周時骨化三醇干預(yù)的Foxp3和IL-10的表達(dá)水平在炎性肌肉中增加,而 TGF-β的表達(dá)降低；甲強(qiáng)龍和聯(lián)合干預(yù)組IL-10表達(dá)繼續(xù)依次增加并且在

8、兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。與模型組相比在4周時，骨化三醇干預(yù)后Foxp3和TGF-β表達(dá)在淋巴結(jié)中增加；在甲強(qiáng)龍和聯(lián)合干預(yù)后TGF-β表達(dá)依次顯著增加,兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　3．小鼠脾臟組織中各因子的 mRNA表達(dá)水平：與模型組相比，骨化三醇干預(yù)組在2周時 Th17細(xì)胞相關(guān)因子IL-17和IL-23的表達(dá)增加,而 IL-6的表達(dá)減低；Foxp3、IL-10和TGF-β的表達(dá)均增加,兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

9、與模型組比較，甲強(qiáng)龍和聯(lián)合干預(yù)后的IL-17表達(dá)增加；IL-10以及TGF-β表達(dá)明顯增加且兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4周處理的各組中，與模型組比較骨化三醇干預(yù)后IL-6、IL-23的表達(dá)減低，IL-17的表達(dá)增加，兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而在甲強(qiáng)龍組和聯(lián)合干預(yù)組中，IL-6表達(dá)降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。三組干預(yù)后的Foxp3的表達(dá)依次減低，IL-10和TGF-β表達(dá)逐漸增加；三組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4．在小鼠血清中，骨化三醇干預(yù)后IL-17、

10、IL-6和IL-23的表達(dá)降低。正常組三種因子的表達(dá)微量，模型組中三種因子的表達(dá)升高；而給予干預(yù)處理后該三種因子的表達(dá)相繼降低，與肌肉中的變化趨勢較一致，并且三組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．無論是在進(jìn)展期還是在持續(xù)期，骨化三醇干預(yù)后的肌炎模型小鼠的一般狀況、肌肉炎性浸潤程度都有所好轉(zhuǎn)；雖然改善程度不如甲強(qiáng)龍，但骨化三醇聯(lián)合甲強(qiáng)龍干預(yù)后的作用效果最好。
　　2．骨化三醇大致降低炎癥肌肉組織中IL

11、-17、IL-6和IL-23mRNA的表達(dá)水平，增加Foxp3、IL-10和TGF-βmRNA的表達(dá)水平，通過作用于Th17/Treg細(xì)胞相關(guān)因子來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，減輕小鼠機(jī)體特別是肌肉組織的炎性浸潤程度，從而改善小鼠的肌力和一般狀況。
　　3．與甲強(qiáng)龍組比較，聯(lián)合干預(yù)后脾臟組織中 Th17細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)無明顯變化，而IL-10和TGF-βmRNA的表達(dá)水平明顯增加；提示骨化三醇是可能主要通過促進(jìn)IL-10和TGF-β的表達(dá)