新型Survivin顯性負(fù)突變體D71A抑制前列腺腫瘤細(xì)胞體內(nèi)外生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前列腺癌發(fā)病率的持續(xù)增長(zhǎng)和死亡率的增加是近年來困擾大家的一個(gè)公眾問題。在歐美國(guó)家，前列腺癌是男性病死率占第二位的惡性腫瘤。近年來盡管在前列腺癌的診斷、治療方面取得了一些進(jìn)展，但像前列腺癌的病因、預(yù)防和治療還存在很多問題，相對(duì)其他大多數(shù)腫瘤，我們對(duì)前列腺癌的了解還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。因此，尋找一種特異性較高的前列腺癌腫瘤標(biāo)記物或癌基因?qū)η傲邢侔┑脑\斷治療有很大的意義。
　　研究表明，腫瘤細(xì)胞凋亡的減少與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的密切相關(guān)。并且使細(xì)胞

2、耐受放療、化療的刺激。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為了一種新的殺傷腫瘤細(xì)胞的治療策略。Survivin定位于17q25，是一個(gè)凋亡抑制基因，屬于IAP家族。它編碼142氨基酸殘疾16.5KD的胞漿蛋白，survivin具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的雙重功能，它抑制凋亡的作用是通過與凋亡效應(yīng)分子caspase3、7直接結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。Survivin主要表達(dá)在細(xì)胞周期的G2/M期，結(jié)合與有絲分裂期的微管，不僅參與細(xì)胞漿分裂，而且參與細(xì)胞有絲分裂

3、的其它諸多方面。分析其表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，survivin在胚胎和幾乎所有的腫瘤組織中表達(dá)，survivin已成為診斷和評(píng)價(jià)預(yù)后的標(biāo)志物。由于它特異性的表達(dá)與促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的功能，使之成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。
　　目的：1.建立一種新型安全有效的前列腺癌基因治療體系；2.研究Survivin-D71A突變基因在體外對(duì)前列腺癌PC3、DU145、LNcap細(xì)胞株的凋亡作用的影響。3.研究Survivin-D71A突變基因在荷前列腺癌裸鼠體內(nèi)對(duì)實(shí)

4、體腫瘤的實(shí)驗(yàn)治療作用。
　　方法：①重組PCR法克隆Survivin-D71A全長(zhǎng)cDNA,構(gòu)建重組腺病毒穿梭載體pshuttle-Survivin-D71A，并與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdessy-1以電穿孔法在BJ5183菌中同源重組，獲得重組腺病毒載體rAdeno-Survivin-D71A。將線性化的rAdeno-Survivin-D71A以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染QBI-293A細(xì)胞，制備和純化復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad-Survivin-

5、D71A。②細(xì)胞計(jì)數(shù)、DAPI染色法、流式細(xì)胞法和Western印跡實(shí)驗(yàn)評(píng)估Ad-Survivin-D71A對(duì)前列腺癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。③將Ad-Survivin-D71A感染前列腺癌細(xì)胞分別接種于裸鼠背部皮下，建立前列腺癌裸鼠皮下移植模型，定期觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，測(cè)定腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。④將前列腺癌細(xì)胞分別接種于裸鼠背部皮下，建立前列腺癌裸鼠皮下移植模型，采取瘤體直接注射的方法將表達(dá)Survivin-D71A的重組腺病毒直接導(dǎo)

6、入瘤體，定期觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，測(cè)定腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。
　　結(jié)果：①構(gòu)建含完整表達(dá)框的重組腺病毒穿梭載體pshuttle-CMV-Survivin-D71A。pshuttle-CMV-Survivin-D71A與pAdessy-1同源重組，獲得重組腺病毒載體rAdeno-Survivin-D71A。線性化的rAdeno-Survivin-D71A在QBI-293A細(xì)胞中包裝、擴(kuò)增、純化、濃縮，經(jīng)TCID50法測(cè)定，獲得滴度

7、約為1×1010pfu/mL的復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad-Survivin-D71A。②細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示Ad-Survivin-D71A組腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力較對(duì)照組明顯降低；DAPI染色顯示，Ad-Survivin-D71A組中凋亡細(xì)胞明顯增多；流式細(xì)胞法檢測(cè)出明顯的凋亡峰，細(xì)胞周期也有所改變，與無任何處理的對(duì)照相比，G2-M期亞群減少，S期亞群增加。Western-blot證實(shí)Survivin表達(dá)受到明顯抑制。③在Ad-Survivi