不同年齡階段山羊瘤胃古菌，細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)組成研究.pdf

1、瘤胃微生物在維持反芻動(dòng)物的健康和提高飼料利用效率方面起著重要的作用而且微生物菌群結(jié)構(gòu)會(huì)隨著年齡的變化而發(fā)生改變。但是現(xiàn)階段關(guān)于瘤胃微生物隨年齡發(fā)展變化的研究鮮見報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)以山羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物，提取瘤胃液總DNA，并利用高通量技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，旨在研究不同年齡階段山羊瘤胃古菌，細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)組成。
　　分別挑選1天、7天、15天、1月、2月、3月、4月、5月、6月齡、1歲、1.5歲和2歲十二個(gè)年齡組共60頭健康的山羊作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其中

2、1天與2歲年齡組僅用于古菌菌群結(jié)構(gòu)的研究，而其他年齡組用于研究古菌和細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)。每個(gè)年齡組5頭羊，所有動(dòng)物按正常飼養(yǎng)管理程序飼養(yǎng)。除一日齡屠宰采樣外，其余年齡組在清晨飼喂后1小時(shí)用胃管經(jīng)食道插入瘤胃，利用真空泵壓力裝置吸取瘤胃內(nèi)容物，抽取大于50ml的瘤胃內(nèi)容物，經(jīng)四層滅菌紗布過濾得瘤胃液，提取瘤胃液微生物總DNA，采用原核生物通用引物對(duì)515F/806R針對(duì)細(xì)菌16SrRNA的V4-V5可變區(qū)進(jìn)行Barcode-PCR擴(kuò)增，采用古菌

3、特異性引物對(duì)349F/806R針對(duì)古菌16SrRNA的V3-V4可變區(qū)進(jìn)行Barcode-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)后送千年基因生物技術(shù)公司用MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。后期數(shù)據(jù)分析主要用QIIME1.8.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)的差異顯著性檢驗(yàn)利用IBM SPSS Statistics22進(jìn)行。
　　結(jié)果顯示:(1)擬桿菌門(Bacteroidetes44.07％±0.09)，變形菌門(Proteobacteria16.97％±0

4、.05)，厚壁菌門(Firmicutes9.45％±0.02)為各年齡組中優(yōu)勢(shì)菌群。擬桿菌門從7日齡到3月齡豐度逐漸升高，隨后逐漸降低，6月齡以后達(dá)到穩(wěn)定，而變形菌門(Proteobacteria)的變化趨勢(shì)與之相反。古菌中廣古菌門(Euryarchaeota84.02％±0.10)和泉古菌門(Crenarchaeota14.38％±0.10)為各年齡組中優(yōu)勢(shì)菌群。廣古菌門(Euryarchaeota)從出生到15日齡豐度逐漸增加，之后

5、豐度雖有波動(dòng)但差異不顯著(P＞0.05)，而泉古菌門(Crenarchaeota)的豐度在1日齡到15日齡變化與廣古菌門(Euryarchaeota)相反，之后變化趨勢(shì)一樣?？品诸愃缴希绽孜质暇疲≒revotellaceae29.87％±0.16），未分類的擬桿菌目(Unclassified Bacteroidales5.60％±0.04)，地桿菌科（Geobacteraceae7.26％±0.07），腸桿菌科（Enterobac

6、teriaceae4.44％±0.47）為各年齡組中優(yōu)勢(shì)菌群。普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)從7日齡到4月齡豐度逐漸增加，從4月齡到1.5歲豐度急劇降低。古菌中，甲烷菌科（Methanobacteriaceae44.91％±0.19），熱原體科（Thermoplasmatales_incertae_se17.99％±0.11）為各年齡組中優(yōu)勢(shì)菌群，且都屬于廣古菌門(Euryarchaeota)。屬分類水平上，普雷沃氏菌屬(

7、Prevotella23.72％±00.17)，地桿菌屬（Geobacter5.60％±0.04），埃希式桿菌屬（Escherichia/Shigella4.11％±0.05），Paraprevotella(1.70％±0.01)為各年齡組中優(yōu)勢(shì)菌群。普雷沃氏菌屬(Prevotella)從出生到3月齡豐度逐漸增加，之后豐度逐漸降低。古菌中，甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter44.66％±0.19），Thermogymno

8、monas(17.99％±0.11)為各年齡組中優(yōu)勢(shì)菌群，且都屬于廣古菌門(Euryarchaeota)。(2)不同年齡組內(nèi)Alpha多樣性分析發(fā)現(xiàn)，7日齡組物種多樣性較其它年齡組高。古菌中6月齡observed_species指數(shù)最高(170.6)，15日齡chao1指數(shù)最高(264.35)，1.5歲shannon指數(shù)最高(4.93)。(3)不同年齡組間Beta分析發(fā)現(xiàn)，1.5歲組內(nèi)個(gè)體物種組成差異性最低（0.60±0.31），而3月

9、齡組內(nèi)個(gè)體物種組成差異性最高(0.76±0.39)。古菌中2歲組內(nèi)個(gè)體間菌群組成的差異性最?。?.19±0.04），而五月齡組內(nèi)個(gè)體間菌群組成的差異性最大（0.61±0.19）。(4)不同年齡組內(nèi)細(xì)菌核心菌群(≥0.1％)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，7日齡菌群共享屬數(shù)量最多(79)，而不同組間共享屬菌群僅有42個(gè)。古菌中，不同年齡組間的核心菌群只有甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter)和Thermogymnomonas。
　　

10、綜上所述，一些在成熟瘤胃中優(yōu)勢(shì)的菌群最早在出生后就被檢測(cè)到，且他們(擬桿菌門Bacteroidetes、變形菌門Proteobacteria、廣古菌門Euryarchaeota和泉古菌門Crenarchaeota)的豐度從出生到成熟呈現(xiàn)規(guī)律性變化。同時(shí)，不同年齡組內(nèi)個(gè)體的細(xì)菌菌群組成雖然在剛出生后一段時(shí)間差異較大，但在動(dòng)物成熟時(shí)其個(gè)體菌群組成逐漸穩(wěn)定（1.5歲），而古菌不同年齡組內(nèi)個(gè)體菌群組成在5月齡之前差異較大，之后的菌群差異逐漸減小