中國(guó)部分地區(qū)2010-2013年基因VII型新城疫病毒F、HN基因分子特征分析及病毒樣顆粒的構(gòu)建.pdf

1、新城疫（New Disease，ND），俗稱亞洲雞瘟，是由新城疫病毒強(qiáng)毒株引起的一種急性、高度接觸性傳染病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將新城疫列為法定報(bào)告疫病。我國(guó)在《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012-2020年）》中把新城疫列為16種國(guó)內(nèi)優(yōu)先防治的動(dòng)物疫病之一。新城疫病毒屬于副粘病毒科（Paramyxoviridae），禽腮腺炎病毒屬（Avulavirus）。對(duì)于新城疫的防控我國(guó)主要依賴疫苗免疫防控新城疫。目前，我國(guó)禽群中普遍使用

2、的弱毒疫苗主要為基因II亞型的La Sota疫苗株，而我國(guó)的優(yōu)勢(shì)流行株為VII型。在遺傳進(jìn)化學(xué)上疫苗株與流行株之間相差較遠(yuǎn)，且抗原差異性也較大，被認(rèn)為是該病在中國(guó)持續(xù)暴發(fā)和免疫失敗的主要原因。雖然La Sota弱毒疫苗能對(duì)雞群提供良好的臨床保護(hù)效果，但在雞群中仍會(huì)出現(xiàn)大量的排毒現(xiàn)象。為更好的應(yīng)對(duì)ND流行，新城疫新型疫苗的研制對(duì)新城疫具有更好的防控意義。本文主要從以下三個(gè)方面進(jìn)行相關(guān)研究：
　　試驗(yàn)一：中國(guó)部分地區(qū)2010-2013

3、年基因VII型NDV F和HN基因分子特征分析
　　本實(shí)驗(yàn)整理了NCBI收錄的2012年以前中國(guó)分離到的所有NDV F全基因序列，共計(jì)452株。通過(guò)核苷酸比對(duì)分析，證實(shí)近年來(lái)我國(guó)主要的流行毒株為ClassII的基因VII型。對(duì)2010-2012年分離的代表株45株和2013年春季流調(diào)代表株14株，共計(jì)59株NDV進(jìn)行了分子遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果證實(shí)基因VIIb亞型52株、基因VIId型3株、基因VIIh4株。隨后對(duì)59株NDV的F和H

4、N基因重要功能區(qū)域的核苷酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分毒株F基因裂解位點(diǎn)和HN基因的重要抗原位點(diǎn)發(fā)生了明顯的變異。
　　試驗(yàn)二：新城疫 VII型疫苗候選株的篩選
　　在NDV F、HN基因分子特征分析的基礎(chǔ)上，挑選8株VII型NDV。經(jīng)致病指數(shù)（MDT、ICPI、IVPI）以及F裂解位點(diǎn)序列分析，證實(shí)8株NDV均為強(qiáng)毒株；攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，La Sota滅活疫苗能對(duì)分離株的攻擊提供臨床保護(hù)，但在攻毒后的第1、3、5天仍可

5、出現(xiàn)排毒現(xiàn)象。最終根據(jù)毒力、雞胚繁殖性能及排毒情況篩選出一株基因VII型疫苗候選株。
　　試驗(yàn)三：基因VII型新城疫病毒樣顆粒疫苗的構(gòu)建
　　使用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，以pFastBac Dual轉(zhuǎn)移載體為骨架，將基因VII型疫苗候選株的全長(zhǎng)F、HN、M、NP基因片段克隆到pFastBac Dual供體質(zhì)粒上，構(gòu)建出重組供體質(zhì)粒。隨后轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒基因組。經(jīng)轉(zhuǎn)染獲得重組桿狀病毒