低劑量砷劑聯(lián)合Cyclopamine對前列腺癌細胞株P(guān)C-3生長影響機制的初步研究.pdf

1、本實驗共分為四個部分： 第一部分：三氧化二砷對前列腺癌PC-3細胞系細胞周期及端粒酶活性的影響我們應(yīng)用體外細胞生長抑制試驗(MTT比色法)研究對PC-3細胞生長的影響；流式細胞儀檢測細胞周期分布情況及凋亡情況；TRAP-ELASA方法檢測藥物作用前后端粒酶的活性。MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6μmol/l As2O3對PC-3細胞即具有抑制作用，隨著濃度的增加和作用時間的延長，抑制作用進一步增強，作用48小時，IC50為16.21μmol/

2、L。18μmol/L的As2O3與PC-3細胞共培養(yǎng)48h后，電鏡下部分癌細胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)改變，經(jīng)6μmol/L、12μmol/L、18μmol/L、24μmol/L的As2O3作用48h后，細胞凋亡率逐漸增加，在流式圖上可見到代表凋亡的亞G1峰，且24μmol/L組、18μmol/L組、12μmol/L組的As2O3組細胞凋亡率明顯高于6μmol/L組(P<0.05)。四組濃度處理后的PC-3細胞凋亡率分別為4.8％，15.2％，1

3、9.6％，29.7％，同正常組比較有顯著性差異(P<0.01)，G0/G1期細胞比例明顯增加，而S期和G2/M期細胞明顯減少。PC-3細胞端粒酶活性隨著作用時間及作用濃度的增加而降低，具有時間劑量效應(yīng)關(guān)系，但當濃度增加至18μmol/L以上時，隨著濃度的增加，對端粒酶活性的抑制無顯著性差異(P>0.05)。 第二部分：三氧化二砷對前列腺癌DU-145細胞周期阻滯及凋亡的影響DU-145也是非雄依賴的前列腺癌細胞系，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，

4、As2O3對DU-145細胞生長具有抑制作用，2μmol/L的As2O3作用24h即對DU-145細胞具有抑制作用，當濃度增加至6μmol/L以上時，抑制作用更為明顯，作用48小時，IC50為8.02μmol/L，作用72小時IC50為6.21μmol/L；電鏡觀察DU-145細胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)：8.0μmol/L的As2O3與DU-145細胞共培養(yǎng)48h后，部分癌細胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)改變，晚期可產(chǎn)生凋亡小體。流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞周

5、期的分布發(fā)現(xiàn)經(jīng)6、8、10μmol/L的As2O3作用48h后，DU-145細胞凋亡率明顯增加，與空白對照組比較有顯著性差異(P<0.01)，G0/G1期細胞比例明顯下降，而G2／M期細胞比例明顯增加，和對照組相比有顯著性差異(P<0.01)，在48小時2μmol/LAs2O3作用組未見代表細胞凋亡的亞G1峰，而在8μmol/L作用組，在正常二倍體峰前面可看到一個明顯的代表凋亡的亞G1峰；As2O3處理DU-145細胞基因組DNA電泳結(jié)

6、果發(fā)現(xiàn)：不同濃度的As2O3處理DU-145細胞48h后，基因組DNA凝膠電泳呈現(xiàn)明顯的梯狀圖譜，這是核小體間DNA成180-200bp整倍斷裂的結(jié)果。 第三部分：Cyclopamine對非雄依賴的前列腺癌PC-3細胞的影響通過MTT檢測Cyclopamine對細胞生長增殖的影響，BrdU摻入檢測PC-3細胞DNA合成的情況，流式檢測Cyclopamine對PC-3細胞周期的影響，TRAP-ELISA法細胞檢測端粒酶的活性。實驗

7、結(jié)果顯示：Cyclopamine可以通過抑制Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而明顯抑制PC-3細胞的增殖，在4-8μmol/L有明顯的抑制作用；BrdU摻入結(jié)果PC-3細胞未加Cyclopamine時BrdU摻入陽性細胞平均約占細胞總數(shù)的79％±5．6，加入2μmol/L的Cyclopamine作用48小時后PC-3細胞BrdU摻入陽性細胞平均約占細胞總數(shù)的49％±8.3，低于對照組79％±5.6(P<0.05)，加入4 μmol/L的Cyclopam

8、ine作用48小時后PC-3細胞BrdU摻入陽性細胞平均約占細胞總數(shù)的30％±6.8，明顯低于對照組(P<0.01)，但加入Tomatidine(Cyclopamine類似物)作用48小時后BrdU摻入陽性細胞平均約占細胞總數(shù)的72％±6.9，與對照組相比差異無顯著性(P>0.05)；流式細胞儀檢測細胞周期的結(jié)果為：4μmol/L的Cyclopamine作用48h后，PC-3細胞進入S期比例由空白對照組的34.8％±1.13下降為13.

9、7％±0.18，G1期的細胞比例由空白對照組的46.8％±1.32下降為34.8％±0.78，G2期的細胞比例由空白對照組的19.7％±0.49上升為52.4％±0.56，Cyclopamine處理組在流式圖上還出現(xiàn)了明顯的凋亡峰；Cyclopamine對PC-3細胞端粒酶活性在低濃度和高濃度時均無明顯抑制作用，并且隨著作用時間的延長，亦無抑制作用。 第四部分：低劑量砷劑聯(lián)合Cyclopamine對前列腺癌細胞株P(guān)C-3生長影響

10、的研究通過MTT檢測不同濃度砷劑聯(lián)合Cyclopamine對PC-3細胞生長的影響，電鏡觀察低劑量砷劑(6μmol/L)和Cyclopamine(2μmol/L)對PC-3細胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響，以流式細胞儀檢測細胞凋亡，TRAP-ELISA檢測端粒酶活性，BrdU摻入方法檢測低劑量砷劑和Cyclopamine對PC-3細胞DNA合成的影響， RT-PCR法檢測GLI1的表達。實驗結(jié)果顯示：低劑量砷劑聯(lián)合Cyclopamine可以明顯

11、抑制PC-3細胞的增殖，作用48h可見細胞凋亡；流式細胞圖發(fā)現(xiàn)經(jīng)6μmol/L的As2O3和2μmol/L的Cyclopamine共同作用48h后，在流式圖上可見到代表凋亡的亞G1峰，聯(lián)合用藥組的細胞凋亡率明顯高于6μmol/L的As2O3組和2μmol/L的Cyclopamine組(P<0.01)，其凋亡率與高濃度As2O3組(18μmol/L)的凋亡率無顯著性差別(P>0.05)，高于4μmol/L的Cyclopamine組(P<0

12、.05)：PC-3細胞對照組BrdU摻入陽性細胞平均約占細胞總數(shù)的79％+2.33，低劑量砷劑和Cyclopamine聯(lián)合用藥組作用PC-3細胞48h后，BrdU摻入陽性細胞數(shù)平均約占細胞總數(shù)的26％+3.82，與單藥作用組分別作用有顯著性差異(P<0.01)，與4μmol/L的Cyclopamine作用組及18μmol/L的As2O3作用組相比則無顯著性差異(P>0．05)；6μmol/L的AS2O3作用PC-3細胞48h后可以抑制端

13、粒酶的活性，吸光度A值為0．792±0．0 11，而聯(lián)合用藥組作用PC-3細胞48h后亦可抑制端粒酶的活性，吸光度A值為0．769±0．045．兩組之間無顯著性差異(P>0．05)；但與對照組相比(A值為0．892±0．021)均有顯著性差異(P<0．05)：RT-PCR結(jié)果顯示，在DNALadder約292bp處出現(xiàn)明暗相間的分子條帶，即為目的基因GLI1；而在約579 bp處出現(xiàn)粗細、明暗均較均一的條帶，此即內(nèi)參GAPDH，說明PC

14、-3細胞GLI1的表達較強，與2μmol/L的Cyclopamine共同作用48h后，GLI1的表達有所減弱，隨著其濃度的增加，在4μmol/L組GLI1的表達進一步減弱，與對照組相比均有顯著性差異(P<0．05)；而聯(lián)合用藥組盡管對GLI1的表達也有抑制，與對照組相比有顯著性差異(P<0．05)，但與2μmol/L的Cyclopamine單獨用藥組相比，抑制作用無增強或減弱，統(tǒng)計學(xué)分析無顯著性差異(P>0．05)，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，無

15、論是低劑量砷劑還是高劑量砷劑，其對GLI1的表達均無影響。 結(jié)論： 一．As2O3可明顯抑制前列腺癌非雄依賴的PC-3細胞的增殖，其途徑可能與以下兩方面機制有關(guān)，一是誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制細胞周期，二是下調(diào)細胞的端粒酶活性，但對Hh信號通路的關(guān)鍵因子GLI1的活性無影響。 二．As203對前列腺癌非雄依賴的DU-145細胞系也有明顯的抑制作用，且隨著藥物濃度增加和作用時間延長，凋亡細胞明顯增加，出現(xiàn)G2/M期阻滯和D

16、NA的斷裂。 三．Cyclopamine可以通過抑制Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而明顯抑制PC-3細胞的增殖和DNA的合成，降低GLI1的表達，抑制細胞的周期，誘導(dǎo)細胞的凋亡，但對細胞端粒酶活性無抑制作用。 四．低劑量砷劑(6μmol/L)和Cyclopamine(2μmol/L)的聯(lián)合應(yīng)用可以抑制PC-3細胞的增殖，并誘導(dǎo)細胞凋亡，細胞凋亡率明顯高于6μmol/L的As203組和2μmol/L的Cyclopamine組，與高濃度A