TNF-a保守序列突變體的構建及其對mTNF-a胞毒效應的影響.pdf

1、腫瘤壞死因子（TNF-a）主要由活化的T細胞、單核/巨噬細胞、NK細胞產生的具有多種生物學功能的細胞因子。它屬于腫瘤壞死因子超家族成員，該家族成員雖然生物學功能各不相同，但它們蛋白質分子一級結構中的氨基酸序列的46-58、119-130、150-157等區(qū)域高度同源（高度保守結構域）；另外它們必須以同源三聚體形式與其相應受體結合才能介導生物學效應。因此，我們推測TNF超家族成員三聚體的形成可能和它們氨基酸序列中高度保守序列有關。本課題采

2、用重疊PCR方法將TNF-a保守序列中的第58位異亮氨酸突變?yōu)槔野彼幔↖58Y），第124位苯丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸（F124S），并將這2個TNF-a突變體分別亞克隆至pIREs-GFP-Xho1質粒，然后，將2個突變體重組質粒分別轉染293T細胞，采用MTT法檢測TNF-a突變體對MCF-7細胞的胞毒效應，為TNF-a分子結構和功能關系的深入研究提供線索，對TNF-a的基礎研究及其臨床應用具有重要的理論意義和實用價值。主要研究結果如下：

3、
　　 ⑴pcDNA3.0-TNF-a突變體重組質粒的構建，克隆及鑒定。①重組體的構建和克?。阂詐cDNA3.0-wtTNF-a質粒為模板，用重疊PCR法定點突變58位（I58Y）、124位（F124S），用BamHI和XhoI對目的基因和 pcDNA3.0載體進行雙酶切，并用T4 DNA連接酶連接，將連接產物轉化DH5a，通過其氨芐抗性挑選陽性克隆。②陽性克隆的鑒定：通過菌落PCR及上述限制性內切酶雙酶切初步鑒定，篩選出陽性克

4、隆，進一步DNA測序分析，證實點突變獲得成功，僅在預計位點發(fā)生突變，其余核苷酸序列與野生型TNF-a序列相同。
　　 ⑵pIREs-GFP-Xho1-TNF-a突變體重組質粒的構建，克隆及鑒定。將熒光載體pIREs-GFP-Xho1質粒用BglⅡ和XhoI進行順序酶切，另外將上述2個突變體重組質粒（I58Y、F124S）和pcDNA3.0-wtTNF-a，用BamHI和XhoI進行雙酶切，取前者酶切的大片段和后者小片段用T4連接

5、酶連接，再轉化入DH5a，通過卡那抗性挑選陽性克隆。以菌落PCR篩選陽性克隆。
　　 ⑶MTT法檢測野生型和各突變型TNF-a的細胞毒效應。將瞬時轉染各突變型TNF-a和野生TNF-a的293T細胞作為效應細胞，以MCF-7為靶細胞，用MTT法比較其胞毒效應。結果顯示I58Y、F124S的二個突變體的胞毒效應分別為13%和23%，其胞毒效應與野生型TNF-a相比明顯降低，分別降低67%和57%。
　　 研究表明：I58Y