ABCA1胞外第一環(huán)缺失突變體構(gòu)建及其抗砷性研究.pdf

1、目的：本課題運(yùn)用改進(jìn)的重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接法(gene splicing by overlap extension ,SOE)分別構(gòu)建缺失ABCA1蛋白胞外第一環(huán)第323-579，535-625位氨基酸密碼子的基因，真核表達(dá)后激光共聚焦顯微鏡觀察突變體表達(dá)情況。同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞砷耐受性實(shí)驗(yàn)，并觀察細(xì)胞內(nèi)砷含量變化及凋亡率檢測(cè)，從而確定突變體是否具有抗砷功能。
　　 方法：應(yīng)用重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接法的原理，在拼接延伸后，再進(jìn)行一次PCR擴(kuò)

2、增，得到ABCA1缺失第323-579，第535-625位氨基酸密碼子的兩條基因，克隆至pcDNA3.1/V5-His 真核表達(dá)載體。在Lipofectamine2000的介導(dǎo)下將突變體真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后突變體的表達(dá)。通過(guò)噻唑籃（MTT）檢測(cè)48h 急性砷染毒后光密度值（OD）計(jì)算生存率及半數(shù)抑制濃度（IC50），分析細(xì)胞抗砷性變化。然后運(yùn)用原子熒光光度法（AFS）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)砷蓄積量的變化。同時(shí)利

3、用annexin-V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)突變體對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響并與完整ABCA1及空載體比較分析。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建缺失ABCA1 蛋白胞外第一環(huán)第323-579位，缺失第535-625位氨基酸密碼子的基因。
　　 通過(guò)激光共聚焦顯微鏡對(duì)pcDNA3.1/ABCA1△323-579AA，pcDNA3.1/ABCA1△535-625AA基因表達(dá)蛋白的細(xì)胞定位情況進(jìn)行了分析。以pcDNA3.1/ABCA1 質(zhì)

4、粒為對(duì)照結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組結(jié)合鼠抗IgG/DyLight488 后受激發(fā)光激發(fā)發(fā)出綠色熒光，均分布在細(xì)胞膜。因此認(rèn)為突變后基因表達(dá)基本沒(méi)有發(fā)生改變，可能定位在細(xì)胞膜上，可以進(jìn)行下一步研究。Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染突變體組1、突變體組2、野生pcDNA3.1/ABCA1 質(zhì)粒組、空載體組后給予不同濃度砷劑孵育48 小時(shí)后用MTT 法測(cè)OD 值計(jì)算生存率及IC50。結(jié)果顯示野生組細(xì)胞在各濃度下生存率均高于同步突變組和空載體組，隨機(jī)區(qū)組方差分析

5、各濃度下野生組與突變組1、突變組2 及空載體組生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；突變組與空載體組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。突變組1、突變組2、空載體組和野生組IC50分別為18.31μmol/l，18.26μmol/l，18.52μmol/l和29.4μmol/l。原子熒光光度法結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組在10 小時(shí)內(nèi)細(xì)胞內(nèi)砷的蓄積量均低于對(duì)照組，annexin-V/P I 雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，NaAsO2作用24h 后實(shí)驗(yàn)組細(xì)