牙鲆胚胎冷凍保存的研究.pdf

1、魚(yú)類配子和胚胎的冷凍保存對(duì)魚(yú)類種質(zhì)資源保護(hù)、低溫生物學(xué)、遺傳育種和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)都具有重要的意義。胚胎的冷凍保存是一項(xiàng)系統(tǒng)工作，一個(gè)環(huán)節(jié)處理不慎，都會(huì)導(dǎo)致整個(gè)保存實(shí)驗(yàn)的失敗。本研究以牙鲆(paralichthys olivaceus)胚胎為材料，對(duì)影響魚(yú)類胚胎冷凍保存的主要環(huán)節(jié)分別進(jìn)行了探討，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了超低溫程序化和玻璃化冷凍保存研究。本研究主要從以下幾個(gè)方面對(duì)海水魚(yú)類胚胎的冷凍保存進(jìn)行了探討： 1.低毒高效的抗凍液是胚胎冷

2、凍保存成功的基礎(chǔ)。通過(guò)魚(yú)類胚胎在抗凍液中處理一定時(shí)間的成活率高低來(lái)篩選改進(jìn)合適的抗凍劑。本實(shí)驗(yàn)改良了程序化冷凍抗凍劑，首先篩選了PM比例，發(fā)現(xiàn)P:M=2:1時(shí)處理的胚胎成活率顯著高于其他比例(p<0.05)。然后對(duì)PM在抗凍劑中的百分比進(jìn)行了篩選，其中經(jīng)過(guò)23％PM21處理過(guò)的牙鲆尾芽期胚胎成活率高于其他。通過(guò)在23％PM2l添加1％PVP(m/m)， 2％PVP(m/m)、DMF(0.1mol/L)、DMSO(0.1mol/L)，得出

3、0.1mol/L DMF較其它能提高胚胎成活率。但差異不顯著(P>0.05)。 2.最佳冷凍程序也是程序化冷凍保存成功的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)降溫速率、植冰溫度做了系統(tǒng)化研究，發(fā)現(xiàn)由室溫開(kāi)始，以2℃/rain的速率降至-12℃，然后植冰，能夠?qū)ε咛ヌ峁┳罴驯Ｗo(hù)。實(shí)驗(yàn)最后在此程序下采用23％PMDMF對(duì)牙鲆尾芽期胚胎進(jìn)行程序化冷凍，共凍存12管，共36粒胚胎，保存5hr后解凍復(fù)溫，洗脫后得到3粒成活胚胎，成活率為8.33％，無(wú)畸形。

4、16℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至孵化出膜后全部死亡。 3.玻璃化液的篩選是玻璃化冷凍保存法的重要環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)在前面的基礎(chǔ)上，篩選了添加1％PVP的35％PM21，并采用1/3(3.3cm)的麥管(以規(guī)格10cm×2.3mm的麥管為準(zhǔn))，成功的對(duì)牙鲆尾芽期胚胎進(jìn)行超低溫冷凍保存，解凍后得到成活胚胎1粒，畸形。孵化至出膜后死亡。 4.本研究通過(guò)顯微注射技術(shù)將抗凍劑直接注射到牙鲆胚胎中，來(lái)實(shí)現(xiàn)牙鲆胚胎的玻璃化低溫冷凍保存。在此研究中，