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1、糖尿病系一組由于胰島素分泌缺陷及(或)其生物學(xué)作用障礙引起的以高血糖為特征的代謝性疾病。隨著人口老齡化,糖尿病的發(fā)病率逐年上升。目前糖尿病已成為繼腫瘤、心血管病之后危害人類健康的第三大疾病。 糖尿病是一種復(fù)合病因的綜合征,與遺傳、自身免疫及環(huán)境因素有關(guān)?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療糖尿病以西藥為主,但這些藥物會(huì)出現(xiàn)繼發(fā)性失效且毒副作用較大,對(duì)糖尿病的并發(fā)癥的防治上也存在不足。而中藥以其毒副作用小、作用溫和持久、具有綜合治療作用以及可延緩并發(fā)癥等
2、優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)受到人們的重視。但中藥量多且作用復(fù)雜,目前降糖中藥主要以動(dòng)物模型來(lái)篩選。該方法存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)且耗費(fèi)大的缺點(diǎn),為了尋找快捷有效的篩選降糖中藥的方法我們進(jìn)行了以下的實(shí)驗(yàn)研究:1、利用STZ制備糖尿病小鼠動(dòng)物模型,觀察中藥R對(duì)糖尿病小鼠的治療作用;2、建立大鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),利用高糖濃度制備肝細(xì)胞損傷模型,以建立篩選降糖中藥的肝細(xì)胞模型;3、降糖中藥的篩選;4、探討有效的降糖中藥對(duì)細(xì)胞模型的治療機(jī)理;實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下。 1.中
3、藥R對(duì)糖尿病小鼠的治療作用 1.1 中藥R能夠明顯降低糖尿病小鼠血糖糖尿病模型小鼠血糖增加,而R大劑量組在給藥14天時(shí)糖尿病模型小鼠血糖明顯降低; 1.2 中藥R能夠改善糖尿病模型小鼠的一般狀況糖尿病模型小鼠的體重減低、飲食量和飲水量增加,而R組小鼠的體重增加、飲食量和飲水量有所降低,一般狀況得到明顯改善; 1.3 中藥R能夠改善糖尿病模型小鼠的病理?yè)p傷病理形態(tài)學(xué)觀察顯示,模型組小鼠胰島萎縮、胰島細(xì)胞數(shù)量減少,有
4、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),中藥R組小鼠的胰島數(shù)量明顯增多,胰島細(xì)胞大小基本正常,淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕,提示R能夠改善模型小鼠的病理?yè)p傷; 2 大鼠原代肝細(xì)胞的分離及其形態(tài)學(xué)觀察 2.1 肝細(xì)胞的分離方法采用兩步灌流法分離SD大鼠肝細(xì)胞,在無(wú)菌狀態(tài)下打開(kāi)腹腔,經(jīng)門靜脈插管,先以流速為30ml/min灌流液開(kāi)放灌注:10min后,改用37℃、0.05%的膠原酶溶液(50ml)以相同速度進(jìn)行循環(huán)灌流10min,剪碎肝臟后水浴搖床20min
5、(200轉(zhuǎn)/min,37℃)臺(tái)盼蘭染色確定肝細(xì)胞的即時(shí)存活率。 2.2 肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察新鮮分離的離體肝細(xì)胞前景干凈,呈單個(gè)分散狀態(tài),圓形、透亮、具有立體感。培養(yǎng)2小時(shí)肝細(xì)胞開(kāi)始貼壁。12小時(shí)后大約有90%以上的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),貼壁24小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,呈典型的上皮樣多角形形態(tài),胞體變平變薄,體積明顯增大,細(xì)胞間出現(xiàn)索狀或肝板狀連接。胞核清晰可見(jiàn)雙核或多核肝細(xì)胞。培養(yǎng)48小時(shí)后肝細(xì)胞肝細(xì)胞死亡較多,形態(tài)呈多角形形態(tài),胞核清晰
6、可見(jiàn)多核和雙核肝細(xì)胞。 3 高糖損傷肝細(xì)胞模型的建立 3.1 模型制備方法采用高濃度葡萄糖(25mmol/L)刺激法,用含25mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)SD大鼠原代肝細(xì)胞,連續(xù)24小時(shí)。 3.2 細(xì)胞模型的病態(tài)表現(xiàn) 3.2.1造模過(guò)程中我們動(dòng)態(tài)觀察了培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的降低程度從造模12h開(kāi)始明顯低于正常組,說(shuō)明高糖環(huán)境可以使肝細(xì)胞利用葡萄糖的能力降低。
7、 3.2.2造模過(guò)程中我們利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞OD值來(lái)反應(yīng)肝細(xì)胞活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組肝細(xì)胞活性從造模6h開(kāi)始明顯低于正常組。 以上結(jié)果說(shuō)明,本研究復(fù)制的篩選降糖中藥的細(xì)胞模型中肝細(xì)胞利用葡萄糖的能力和肝細(xì)胞活性明顯降低,利用此模型篩選降糖藥物能夠較好的反映藥物對(duì)肝細(xì)胞利用葡萄糖能力的影響和藥物對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用。 4 篩選有效的降糖中藥 通過(guò)大量的文獻(xiàn)閱讀,我們選取了六種已報(bào)道的具有降糖作用的六種中藥組分:Rg、
8、Rt、Dg、Dt、Tg、Tt,利用建立的篩選降糖中藥的細(xì)胞模型,對(duì)其降糖效果和對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作一評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):Rg、Rt、Dg、Dt有明顯的降低培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的作用,對(duì)肝細(xì)胞也有一定的保護(hù)作用。Tg、Tt在這兩方面的作用與模型組相比均沒(méi)有差異。故本研究對(duì)Rg、Rt、Dg、Dt的降糖機(jī)理作進(jìn)一步探討。 5 R g、Rt、Dg、Dt的降糖機(jī)理研究 本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR法研究Rg、Rt、Dg、Dt對(duì)肝臟糖代謝關(guān)鍵酶糖原
9、合成酶和葡萄糖6磷酸酶mRNA表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示,模型組糖原合成酶mRNA表達(dá)降低,葡萄糖6磷酸酶的兩種亞基葡萄糖6磷酸酶催化亞基(G-6-PC)和葡萄糖6磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)亞基(G-6-PT)mRNA表達(dá)增高,與正常組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。Rg和Rt能明顯增加肝細(xì)胞胞糖原合成酶mRNA表達(dá),與模型組相比統(tǒng)計(jì)具有顯著性差異,但對(duì)G-6-PC和G-6-PTmRNA表達(dá)沒(méi)有影響;Dg和Dt能明顯增高肝細(xì)胞胞糖原合成酶mRNA表達(dá),能明顯降低G
10、-6-PC和G-6-PTmRNA表達(dá),與模型組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。 通過(guò)本研究,我們首先在動(dòng)物模型上驗(yàn)證了中藥R對(duì)糖尿病的治療作用,然后利用高糖刺激肝細(xì)胞,首次建立了一種能夠篩選降糖中藥的高糖損傷細(xì)胞模型,此模型具有簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn):并且利用此模型驗(yàn)證了Rg、Rt、Dg、Dt的降糖效果;然后對(duì)這四種組分進(jìn)行了初步的降糖機(jī)理研究,Rg、Rt、Dg、Dt通過(guò)影響肝臟糖代謝而實(shí)現(xiàn)降糖作用,這為臨床用藥提供了科學(xué)依據(jù),也為后期開(kāi)
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