14-3-3蛋白對活化的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)炎癥相關(guān)因子的影響及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、本文主要從以下三個部分展開論述：
　　第一部分:脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活對14-3-3蛋白表達(dá)變化的研究
　　目的:觀察14-3-3蛋白在小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)及脂多糖誘導(dǎo)后的表達(dá)變化。
　　方法:脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)劑量100ng/ml,以BV-2細(xì)胞作為小膠質(zhì)細(xì)胞的體外細(xì)胞模型,LPS作用BV-2細(xì)胞后,分別收集細(xì)胞和細(xì)胞上清,用免疫熒光、流式細(xì)胞儀、免疫印跡法(Western

2、blot)檢測細(xì)胞中14-3-3蛋白的表達(dá),ELISA法測定細(xì)胞上清中白細(xì)胞介素1-β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平,酶法測定細(xì)胞上清中一氧化氮(NO)的含量。
　　結(jié)果:LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活,大量釋放炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α及NO,與靜息的小膠質(zhì)細(xì)胞相比IL-1β、TNF-α、NO分別在6小時、2小時、12小時達(dá)高峰(P<0.01),并持續(xù)至24小時,同時14-3-3蛋白表達(dá)水平下降(P<0.0

3、5)。
　　結(jié)論:在LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活中,14-3-3蛋白的表達(dá)減少,同時IL-1β、TNF-α及NO的分泌增加。14-3-3蛋白在小膠質(zhì)細(xì)胞的活化過程中發(fā)揮了作用。
　　第二部分:14-3-3蛋白過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α、iNOS的影響
　　目的:觀察14-3-3蛋白在小膠質(zhì)細(xì)胞中的過表達(dá)對脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活及釋放IL-1β、TNF-α、iNOS的影響。
　　方

4、法:用脂質(zhì)體2000(Lipofectamine2000)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)14-3-3ε質(zhì)粒到BV-2細(xì)胞中,再用LPS作用于小膠質(zhì)細(xì)胞,設(shè)未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對照組,免疫印跡法(Western blot)檢測轉(zhuǎn)染效率。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測IL-1βmRNA、TNF-αmRNA、iNOSmRNA的表達(dá)。ELISA法測定細(xì)胞上清中白細(xì)胞介素1-β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平,酶法測定細(xì)胞上清中

5、一氧化氮(NO)的含量。
　　結(jié)果:pcDNA3.1(+)14-3-3ε質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組14-3-3蛋白表達(dá)明顯高于未轉(zhuǎn)染組(P<0.01)。14-3-3蛋白過表達(dá)的BV-2細(xì)胞,LPS的激活作用受到抑制,IL-1βmRNA、TNF-αmRNA、iNOSmRNA的表達(dá)較未轉(zhuǎn)染的對照組下降(P<0.05)。細(xì)胞上清中 IL-1β、TNF-α、NO分泌減少(P<0.05)。
　　結(jié)論:14-3-3蛋白的過表達(dá)可以減輕LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)

6、細(xì)胞的激活,下調(diào)IL-1βmRNA、TNF-αmRNA、iNOSmRNA的表達(dá),減少IL-1β、TNF-α、NO的釋放。
　　第三部分:BV-2細(xì)胞激活的條件培養(yǎng)液對SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響14-3-3蛋白抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活的NF-κB途徑探討
　　目的:觀察BV-2細(xì)胞激活的條件培養(yǎng)液對SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響。14-3-3蛋白對BV-2細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)-D

7、NA活性的影響。
　　方法:以SH-SY5Y細(xì)胞作為多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞模型,用LPS激活BV-2細(xì)胞和14-3-3蛋白過表達(dá)BV-2細(xì)胞后的細(xì)胞上清作為條件培養(yǎng)液(Microglia conditioned medium, MCM;14-3-3 protein overexpression Microglia conditioned medium, OMCM),處理SH-SY5Y細(xì)胞,并設(shè)空白對照組,應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽法(MTT法

8、)檢測SH-SY5Y細(xì)胞存活率,磷脂結(jié)合蛋白(AnnexinⅤ)-碘化丙啶(PI)雙染色流式細(xì)胞儀檢測SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。應(yīng)用凝膠電泳遷移率實驗( electrophoretic mobility shift assay, EMSA)測定小膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB-DNA的結(jié)合活性。
　　結(jié)果:與空白組相比,受MCM處理的SH-SY5Y細(xì)胞,存活率明顯下降,細(xì)胞凋亡率增加(P<0.01),受OMCM處理的SH-SY5Y細(xì)胞,其存活

9、率較MCM組上升,細(xì)胞凋亡率下降(P<0.01)。而單獨(dú)用LPS作用于SH-SY5Y細(xì)胞,其存活率及凋亡率與空白組相比無明顯差別(P>0.05)。LPS誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞激活后,BV-2細(xì)胞的NF-κB-DNA的結(jié)合活性明顯提高(P<0.01)。在LPS誘導(dǎo)的14-3-3蛋白過表達(dá)BV-2細(xì)胞中NF-κB-DNA的結(jié)合活性明顯下降(P<0.01)。
　　結(jié)論:活化的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放致炎性細(xì)胞因子對多巴能神經(jīng)元具有損傷作用。14-3-3