中國(guó)明對(duì)蝦C-型凝集素的重組表達(dá)和功能分析以及對(duì)蝦素與防御素融合抗菌肽表達(dá)載體構(gòu)建、重組表達(dá)和性質(zhì)分析.pdf

1、中國(guó)對(duì)蝦是我國(guó)重要的海產(chǎn)養(yǎng)殖品種，具有重要的經(jīng)濟(jì)地位。大規(guī)模的養(yǎng)殖使對(duì)蝦傳染性疾病頻發(fā)，造成重大經(jīng)濟(jì)損失，因而，找到有效預(yù)防和診斷治療對(duì)蝦疾病的方法迫在眉睫。利用一系列的生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法，研究對(duì)蝦先天免疫相關(guān)基因C-型凝集素及其功能，能夠在一定層面上提供對(duì)蝦免疫機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為對(duì)蝦疾病的防治提供理論依據(jù)。針對(duì)海水養(yǎng)殖業(yè)病害發(fā)生的現(xiàn)狀，從篩選和克隆海洋動(dòng)物抗病功能基因-抗菌肽基因入手，應(yīng)用基因工程手段獲得抗菌肽融合基因，以期研制安全

2、、高效、廣譜的抗細(xì)菌、抗病毒的重組抗病蛋白漁藥，從而減少養(yǎng)殖病害發(fā)生，提高水產(chǎn)品質(zhì)量，保障水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展。 本論文主要報(bào)道了中國(guó)明對(duì)蝦先天免疫中重要的模式識(shí)別蛋白(patternrecognition proteins，PRPs)C-型凝集素的重組表達(dá)及功能分析；利用基因工程手段獲得融合表達(dá)抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)并研究其抗菌功能。主要結(jié)果如下： 1.中國(guó)明對(duì)蝦C-型凝集素的

3、重組表達(dá)和功能分析無(wú)脊椎動(dòng)物通過(guò)模式識(shí)別受體識(shí)別病原微生物細(xì)胞表面特異保守的糖分子，從而能夠識(shí)別入侵微生物。C-型凝集素屬于模式識(shí)別蛋白，在對(duì)蝦先天免疫中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)室從中國(guó)明對(duì)蝦中克隆得到一種新型的C-型凝集素，命名為Fc-hsL，并發(fā)現(xiàn)其與免疫聯(lián)系緊密。 本論文在原核表達(dá)系統(tǒng)中大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白Fc-hsL，利用純化的重組蛋白進(jìn)行了一系列性質(zhì)研究。凝集實(shí)驗(yàn)證明，F(xiàn)c-hsL成熟肽在鈣離子存在情況下可以凝集革蘭氏陽(yáng)性

4、菌和革蘭氏陰性菌，包括：巨大芽孢桿菌，大腸桿菌等。細(xì)菌結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重組蛋白可以結(jié)合巨大芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌，以及部分革蘭氏陰性菌，如革蘭氏陰性菌大腸桿菌和肺炎克雷伯氏桿菌。通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)c-hsL對(duì)甘露糖、半乳糖、脂多糖等都有結(jié)合能力，對(duì)甘露糖的結(jié)合能力大于對(duì)半乳糖的結(jié)合能力。通過(guò)管碟法和液體生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)等方法測(cè)試重組蛋白的抑菌活性和最小抑菌濃度(MIC)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和真

5、菌的抑菌能力較強(qiáng)，對(duì)革蘭氏陰性菌有一定的抑菌能力。 2.融合抗菌肽表達(dá)載體構(gòu)建、重組表達(dá)和性質(zhì)分析抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是先天免疫系統(tǒng)重要的組成成分。本實(shí)驗(yàn)室從家蠅(Musca domestica)中克隆得到的防御素(Musca sticadefensin，Mdde)具有抗革蘭氏陽(yáng)性菌和部分革蘭氏陰性菌的活性(Wang et aL，2006)。中國(guó)明對(duì)蝦對(duì)蝦素(penaeidin 5)是

6、本實(shí)驗(yàn)室從其血細(xì)胞中克隆得到的，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌，陰性菌和真菌有抗性，最小抑菌濃度(MIC)分別：6.3-25.0μM，12.5-50μM，6.25-12.5μM(Kang et aL，2007)。 本論文通過(guò)重疊延伸PCR的方法將中國(guó)明對(duì)蝦對(duì)蝦素-5(penaeidin 5)和家蠅防御素Mdde基因片段融合，構(gòu)建表達(dá)載體pET30a-pen-mdde。這個(gè)方法的核心就在于設(shè)計(jì)兩對(duì)引物。首先位于融合基因后端的Mdde的前引物引入p

7、enaeidin5末端的22個(gè)核苷酸：其次penaeidin 5的前引物和Mdde的后引物引入EcoR1和XhoI酶切位點(diǎn)。本論文成功地在大腸桿菌中大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)，并純化得到了融合蛋白。利用管碟法和液體生長(zhǎng)抑制法進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)重組蛋白有抗菌活性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌，陰性菌和真菌的最小抑菌濃度分別為：0.3-2.4μM，1.2-2.4μM，0.3-2.7μM。和單獨(dú)的抗菌肽相比，融合蛋白對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌以及真菌的抗性都大大增強(qiáng)，例

8、如：對(duì)蝦素-5抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，陰性菌和真菌所需最小的濃度分別為：6.3μM，12.5μM，6.25μM(Kang et aL，2007)，而融合蛋白重組蛋白為：0.3μM，1.2μM，0.3μM，其中，對(duì)真菌蘋(píng)果炭疽菌(Glomerella album)和革蘭氏陽(yáng)性菌蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis)的最小抑菌濃度為0.3μM。而且融合蛋白保留了對(duì)蝦素penaein5和家蠅防御素Mdde對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抗性大于