中國(guó)明對(duì)蝦SWD抗菌肽、谷氨酰胺合成酶和Ras基因的表達(dá)與功能研究.pdf

1、甲殼動(dòng)物集約化的水產(chǎn)養(yǎng)殖，特別是對(duì)蝦的養(yǎng)殖，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中增長(zhǎng)最快的產(chǎn)品之一。盡管取得了巨大的成功，但是對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)仍面臨著嚴(yán)重傳染性疾病暴發(fā)流行的危險(xiǎn)，這給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。自上世紀(jì)90年代以來(lái)，商業(yè)化的對(duì)蝦養(yǎng)殖面臨著嚴(yán)重的打擊，病毒和弧菌引起的蝦病的暴發(fā)流行，給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。 疾病的爆發(fā)常由三種因素的相互作用引起，即惡化的環(huán)境、弱抵抗力的宿主、侵略性的病原菌。甲殼動(dòng)物沒(méi)有獲得性免疫；但具有先天性免疫包括

2、酚氧化酶原系統(tǒng)激活引起的黑化作用，對(duì)外源物質(zhì)的凝結(jié)、吞噬作用和包囊作用，抗菌作用和細(xì)胞凝集作用。抗菌肽通常是小的陽(yáng)離子分子，廣泛分布于整個(gè)生物王國(guó)，特別是對(duì)缺乏獲得性免疫的生物是必須的。 疾病的控制和生物安全目前被認(rèn)為是影響對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展的最關(guān)鍵因素。增強(qiáng)對(duì)蝦的先天免疫可以提高對(duì)病原微生物感染的廣譜抵抗力，激活或提高先天免疫系統(tǒng)能力的各種免疫增強(qiáng)藥物的活性被普遍認(rèn)為是一個(gè)用于提高養(yǎng)殖對(duì)蝦的健康和抵抗流行病暴發(fā)很好的選擇。

3、免疫增強(qiáng)藥物是那些能夠刺激免疫反應(yīng)和提高免疫系統(tǒng)抵抗感染和疾病能力的物質(zhì)。如β-葡聚糖能夠增強(qiáng)甲殼動(dòng)物抵抗寄生蟲(chóng)、細(xì)菌和病毒的感染能力。 來(lái)自對(duì)蝦自身的抗菌肽應(yīng)用于預(yù)防控制對(duì)蝦疾病，即可以提高對(duì)蝦的先天免疫力、抵抗病原微生物的入侵，又可以確保生物安全，因此研究對(duì)蝦的抗菌肽，特別是具有雙重功能的抗菌肽具有重要意義。 抗菌肽在對(duì)蝦體內(nèi)行使功能不是獨(dú)立完成的，需要免疫系統(tǒng)和免疫相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的因子及其它因子的參與，因此研究

4、免疫相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中起作用的基因，了解對(duì)蝦的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在病原微生物入侵時(shí)在先天免疫中的作用具有重要意義，進(jìn)而可以更好的了解對(duì)蝦抵抗病原微生物的機(jī)制。 目前的研究表明含有WAP結(jié)構(gòu)域的蛋白，具有蛋白酶抑制活性或抗菌活性。對(duì)蝦同其它海洋無(wú)脊椎動(dòng)物一樣，免疫相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制目前研究的還比較少。 本研究對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦含單一乳清酸性蛋白結(jié)構(gòu)域的抗菌肽基因、中國(guó)明對(duì)蝦谷氨酰胺合成酶(Fc-GS)基因、中國(guó)明對(duì)蝦Ras基因進(jìn)行了

5、克隆鑒定，并對(duì)其蛋白功能進(jìn)行了初步探討，為進(jìn)一步了解中國(guó)明對(duì)蝦的免疫防御機(jī)制和免疫相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制提供理論依據(jù)。 一、中國(guó)明對(duì)蝦Fc-SWD的功能研究 對(duì)蝦依靠先天免疫系統(tǒng)生活于水生環(huán)境中并承受著各種壓力，如細(xì)菌、真菌、病毒的入侵?？咕牡纳珊歪尫攀堑挚惯@些病原菌入侵的重要免疫反應(yīng)。 從中國(guó)明對(duì)蝦的血細(xì)胞中克隆到了一個(gè)含單一WAP結(jié)構(gòu)域的新型抗菌肽，命名為含單一乳清酸性蛋白結(jié)構(gòu)域的抗菌肽。該抗菌肽cDNA全長(zhǎng)

6、399bp，含有一個(gè)273bp的開(kāi)放閱讀框，編碼90個(gè)氨基酸，包含24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和66個(gè)氨基酸的成熟肽。序列比較和進(jìn)化樹(shù)分析表明，對(duì)蝦中已報(bào)道的含有WAP結(jié)構(gòu)域的肽/蛋白分成3類：crustinⅠ、Ⅱ和SWD。Fc-SWD是SWD亞族的新成員。 Northernblot分析表明Fc-SWD轉(zhuǎn)錄體在正常對(duì)蝦血細(xì)胞中組成型表達(dá)，在感染的對(duì)蝦血細(xì)胞中表達(dá)增加。但是在正常和感染對(duì)蝦的心臟、肝胰腺、胃、鰓、腸、卵巢中未檢測(cè)到表達(dá)。R

7、T-PCR結(jié)果表明在正常和刺激的對(duì)蝦血細(xì)胞、心臟、鰓中及感染對(duì)蝦的胃中有Fc-SWD的表達(dá)。原位雜交結(jié)果表明Fc-SWD在對(duì)蝦三種血細(xì)胞中均有表達(dá)，但是在其中的一類細(xì)胞中mRNA的表達(dá)信號(hào)最強(qiáng)；免疫組化結(jié)果也表明Fc-SWD蛋白在某一類細(xì)胞中有很強(qiáng)的表達(dá)信號(hào)；這些結(jié)果表明Fc-SWD在對(duì)蝦某一類血細(xì)胞高表達(dá)而不是所有細(xì)胞中表達(dá)。 Westernblot分析表明Fc-SWD在血細(xì)胞和血淋巴中均有信號(hào)檢出，且血細(xì)胞中的分子量大于血淋

8、巴中的分子量，說(shuō)明Fc-SWD在血細(xì)胞中合成且含有信號(hào)肽，當(dāng)病原菌感染時(shí)以成熟肽分泌到血淋巴中發(fā)揮作用。 成功構(gòu)建了Fc-SWD基因的三種原核表達(dá)載體：原核重組表達(dá)載體Fc-SWD，mFc-SWD和Fc-WAPD，并對(duì)三種蛋白進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)和純化；利用牛津杯法和最小抑菌濃度的方法研究了純化后三種重組蛋白的抗菌活性；利用生物化學(xué)和酶學(xué)方法分析了純化后三種重組蛋白的抑制蛋白酶活性。結(jié)果表明重組蛋白Fc-SWD和mFc-SWD對(duì)革蘭氏

9、陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真菌都有抑制作用，并且對(duì)枯草蛋白酶A和蛋白酶K有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)胰蛋白酶的抑制作用較弱；Fc-SWPD幾乎沒(méi)有抑菌作用，但是有抑制蛋白酶的活性，對(duì)枯草蛋白酶A和蛋白酶K的抑制作用強(qiáng)于對(duì)胰蛋白酶的抑制作用。 這些研究結(jié)果表明Fc-SWD可能是對(duì)蝦抵抗各種病原菌的免疫系統(tǒng)中重要的效應(yīng)因子之一。Fc-SWD具有抗菌作用和抑制蛋白酶作用，是一種具有雙重功能、具有廣泛的開(kāi)發(fā)前景和藥用價(jià)值的生物活性肽。 二、

10、中國(guó)明對(duì)蝦Fc-GS的功能分析 谷氨酰胺合成酶是一個(gè)廣泛分布的酶，以3種不同的蛋白形式存在于所有生物體中：GSⅠ型家族，主要在原核生物中發(fā)現(xiàn)；GSⅡ型家族，主要存在于真核生物中和少數(shù)細(xì)菌中；GSⅢ型家族主要在原核生物中發(fā)現(xiàn)。 GS在免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、細(xì)胞增殖與分化、胚胎發(fā)育、大分子合成、圍食膜基質(zhì)的形成等方面發(fā)揮著重要作用。 本試驗(yàn)成功克隆到了中國(guó)明對(duì)蝦Fc-GS基因，其cDNA全長(zhǎng)1376bp，含有一個(gè)108

11、6bp的開(kāi)放閱讀框，編碼361個(gè)氨基酸。編碼蛋白的分子量約40.47kDa、等電點(diǎn)為6.32。同源性比較和進(jìn)化樹(shù)分析表明中國(guó)明對(duì)蝦Fc-GS基因?qū)儆贕SⅡ家族。 利用RT-PCR方法對(duì)細(xì)菌或病毒感染對(duì)蝦的血細(xì)胞、心臟、肝胰腺、胃、鰓、腸和卵巢中Fc-GS的表達(dá)進(jìn)行了分析；同時(shí)也對(duì)感染后不同時(shí)間段的肝胰腺、鰓和卵巢的表達(dá)情況進(jìn)行了分析；結(jié)果表明病原菌感染的對(duì)蝦中，F(xiàn)c-GS的表達(dá)在基因水平上被高度調(diào)控。細(xì)菌和病毒感染對(duì)蝦的胃和腸中

12、的Fc-GSmRNA表達(dá)水平明顯增加；病毒感染對(duì)蝦血細(xì)胞、鰓和卵巢中Fc-GSmRNA水平顯著上調(diào)，細(xì)菌感染的鰓中Fc-GS表達(dá)量增加。 利用Westernblot方法對(duì)正常、弧菌刺激和對(duì)蝦白斑綜合征病毒刺激對(duì)蝦的肝胰腺、心臟、胃、腸、卵巢和肌肉組織中Fc-GS的蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行了分析，結(jié)果表明在檢測(cè)的組織中均有表達(dá)，并且弧菌和WSSV刺激的胃、腸和卵巢中Fc-GS的表達(dá)明顯增加。細(xì)菌和病毒感染的鰓、胃、腸和肌肉中Fc-GS蛋

13、白也被誘導(dǎo)表達(dá)。 成功構(gòu)建了中國(guó)明對(duì)蝦Fc-GS的原核表達(dá)載體，得到了重組蛋白，并對(duì)重組蛋白和對(duì)蝦肌肉中Fc-GS進(jìn)行了酶學(xué)分析。酶活性分析表明原核重組表達(dá)的重組中國(guó)明對(duì)蝦Fc-GS合成酶活性最佳pH是6.0-7.5，最佳溫度是37℃。細(xì)菌和病毒感染對(duì)蝦肌肉中Fc-GS的合成酶活性與正常對(duì)蝦的相比顯著增加。與正常對(duì)蝦相比，細(xì)菌或病毒感染的對(duì)蝦肌肉中Fc-GS的合成酶活性增加了2倍。 這些結(jié)果表明中國(guó)明對(duì)蝦Fc-GS可能在

14、抵抗病原微生物入侵，特別是病毒感染的免疫反應(yīng)中起作用。基因和蛋白的上調(diào)作用可以作為檢測(cè)對(duì)蝦被病毒感染雙重標(biāo)準(zhǔn)。 該基因的研究對(duì)了解中國(guó)明對(duì)蝦Fc-GS參與抗病毒免疫相關(guān)的作用機(jī)制提供了參考依據(jù)。為了解中國(guó)明對(duì)蝦被病原菌感染后的健康狀態(tài)提供了方法依據(jù)。 三、中國(guó)明對(duì)蝦Fc-Ras特性分析 原癌基因Ras是一種多功能的細(xì)胞因子，該基因編碼的蛋白是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要組織者，直接參與細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和影響其它細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

15、。Ras蛋白是一種小GTP結(jié)合蛋白，對(duì)細(xì)胞外信息的跨膜傳遞起著重要作用，被稱為細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)傳遞中的“分子開(kāi)關(guān)”。 克隆到的中國(guó)明對(duì)蝦Fc-Ras基因cDNA全長(zhǎng)為1013bp，含有561bp的開(kāi)放閱讀框編碼186個(gè)氨基酸。編碼區(qū)含有3個(gè)EGF_1位點(diǎn)；1個(gè)2FE2S_FER_1位點(diǎn)；編碼蛋白的分子量約21kDa、等電點(diǎn)為6.37。 用RT-PCR的方法分析Fc-Ras在正常、弧菌或WSSV刺激的對(duì)蝦血細(xì)胞、心臟、肝胰腺、

16、胃、鰓、腸、卵巢或精巢的表達(dá)模式。與正常對(duì)蝦相比，弧菌刺激后的血細(xì)胞、肝胰腺、鰓、胃中Fc-RasmRNA的表達(dá)明顯增加；心臟、卵巢中的表達(dá)降低；刺激的腸中僅有微弱的增加。WSSV刺激對(duì)蝦的血細(xì)胞、心臟、鰓、胃、腸、卵巢、精巢中Fc-RasmRNA表達(dá)量明顯增加，肝胰腺中增加不明顯。用Westernblot方法分析了中國(guó)明對(duì)蝦Fc-Ras在不同組織中的表達(dá)變化：正常的胃、腸中沒(méi)有Fc-Ras蛋白的表達(dá)，但是菌刺、毒刺胃和腸中Fc-Ras

17、蛋白高表達(dá)；正常、菌刺、毒刺卵中均有Fc-Ras表達(dá)，且表達(dá)量增加。免疫組化的結(jié)果表明中國(guó)明對(duì)蝦血細(xì)胞中有Fc-Ras的表達(dá)但是并不是所有的細(xì)胞都有很強(qiáng)的表達(dá)，而某一類細(xì)胞整體有很強(qiáng)的表達(dá)信號(hào)。 WSSV刺激后的各組織中mRNA水平均有不同程度的增加，在檢測(cè)的各組織中Fc-Ras蛋白的表達(dá)也增加，這些研究結(jié)果表明Fc-Ras可能參與對(duì)蝦抗WSSV的免疫。對(duì)了解先天免疫相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在病原微生物入侵對(duì)蝦時(shí)所起的作用具有重要意義