重組胱抑素C的表達及免疫活性分析.pdf

1、目的:
　　1.表達和純化重組的人胱抑素C(cystatin C，CysC)蛋白;
　　2.鑒定純化的重組CysC蛋白;
　　3.重組CysC蛋白的免疫活性的檢測。
　　方法:
　　1.根據(jù)GenBank中人Cys C功能區(qū)的氨基酸序列，選擇大腸埃希菌喜好的編碼密碼子設(shè)計合成編碼基因序列，利用PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）獲取目的片段，在原核系統(tǒng)中表達重組人胱抑素C蛋白。
　　2.純化表達的CysC重組蛋白

2、，用間接酶聯(lián)免疫吸附測定法（間接ELISA法）測定其反應(yīng)靈敏度及免疫活性。
　　結(jié)果:
　　1.PCR擴增CysC后經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在250～500bp位置處發(fā)現(xiàn)唯一一條清晰的、大小約為450bp的DNA條帶，相對分子質(zhì)量大小與Cys C基因大小相符，因此可初步確定為目的條帶。構(gòu)建的重組載體pMD18-T-Cys C，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定后可見兩條條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，經(jīng)過上海生工公司測序，證明為C

3、ysC編碼序列;
　　2.將連接表達載體的連接物誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE后發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的菌株表達了一個大小約為35kD的蛋白，而在對照組中沒有出現(xiàn)這一條帶，初步說明重組基因在大腸桿菌中獲得了有效表達;
　　3.Western Blotting結(jié)果顯示，表達的重組蛋白與抗Cys C多克隆抗體在大小約為35kD處發(fā)生了反應(yīng)，而陰性對照則沒有此條帶的出現(xiàn)，進一步說明了重組蛋白為Cys C蛋白，并且具有良好的免疫反應(yīng)活性;