人IFN-γ在表達(dá)HBsAg肝細(xì)胞中的特異性表達(dá)及其體外抑制乙肝病毒的作用.pdf

1、干擾素γ(interferon gamma, IFNγ)在宿主抵抗肝炎病毒的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。IFNγ能通過(guò)非細(xì)胞溶解方式抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染肝細(xì)胞中HBV的復(fù)制中間體并降解HBV在復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生的前基因組RNA，從而顯著降低了細(xì)胞中的病毒水平。IFNγ的這些作用已經(jīng)在細(xì)胞水平和HBV轉(zhuǎn)基因或HBV感染的動(dòng)物模型中得到證實(shí)。然而在臨床上如果給HBV患者全身應(yīng)用重組人IFNγ，為了保證I

2、FNγ在肝細(xì)胞中達(dá)到有效治療濃度，就需要較大劑量的應(yīng)用IFNγ以獲得相應(yīng)的血藥濃度，這樣就會(huì)導(dǎo)致因IFNγ帶來(lái)的嚴(yán)重全身不良反應(yīng)而停止治療的后果。因此，建立一種肝細(xì)胞特異性的、可調(diào)控的IFNγ表達(dá)的基因治療方法成為最佳解決方案。
　　我國(guó)是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，我國(guó)一般人群的HBV表面抗原(hepatitis B virussurface antigen，HBsAg)攜帶率高達(dá)10％，約占全世界HBsAg攜帶者人數(shù)的1/3以上，其中7

3、5-90％的原發(fā)性肝癌與此有關(guān)。由于整合在人體基因組的HBV基因片段中，以S基因、X基因和增強(qiáng)子Ⅰ最多，其中S基因啟動(dòng)子具有很強(qiáng)的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄功能，HBsAg過(guò)表達(dá)是肝細(xì)胞變性壞死的原因之一。根據(jù)這一特性，我們構(gòu)建了具有內(nèi)源性生理調(diào)控功能的人IFNγ表達(dá)載體，能夠介導(dǎo)目的基因在表達(dá)HBsAg肝細(xì)胞中的特異性表達(dá)。通過(guò)以HBV持續(xù)轉(zhuǎn)錄的S基因?yàn)榘谢?，利用生理調(diào)控性的基因治療載體，攜帶效應(yīng)基因IFNγ，能很好的提高局部感染肝細(xì)胞周?chē)腎FNγ

4、濃度，細(xì)胞特異性地非細(xì)胞溶解性清除HBV。由于載體的細(xì)胞特異性調(diào)控作用，未感染病毒的肝細(xì)胞周?chē)腎FNγ濃度不會(huì)增高，并且IFNγ的表達(dá)也不會(huì)處于無(wú)調(diào)控的持續(xù)表達(dá)狀態(tài)，因此不會(huì)高水平激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)，誘發(fā)肝細(xì)胞大量壞死，造成暴發(fā)性肝炎的發(fā)生。
　　第一部分在表達(dá)HBsAg肝細(xì)胞中特異性表達(dá)的人IFNγ真核表達(dá)載體（pcDNA3.1-SCⅡ）的構(gòu)建
　　目的:
　　課題組成員在既往工作中成功構(gòu)建了含有效生物學(xué)功能的丙型肝

5、炎病毒(hepatitis Cvirus，HCV)核糖體插入位點(diǎn)（internal ribosome entry site，IRES）的雙順?lè)醋诱婧吮磉_(dá)載體。為了建立一種用于HBV基因治療的，以非病毒載體介導(dǎo)的肝細(xì)胞特異性IFNγ表達(dá)的基因遞送系統(tǒng)，我們利用上述HCV IRES，以pcDNA3.1載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建以HBV S基因?yàn)榘谢颍琁FNγ基因?yàn)樾?yīng)基因的雙順?lè)醋诱婧吮磉_(dá)載體。
　　方法:
　　根據(jù)既往研究中的方法，P

6、CR擴(kuò)增出具有有效生物學(xué)活性的HCV IRES。然后，我們以pcDNA3.1載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體:在IRES位點(diǎn)的上游克隆HBsAg基因的部分反向序列和HCV全長(zhǎng)核心蛋白(core protein)基因，在IRES位點(diǎn)下游克隆人IFNγ基因。這樣，在pcDNA3.1載體的巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)啟動(dòng)子下依次驅(qū)動(dòng)部分HBV反義S基因(antisense Sgene)、HCV核心蛋白基因，下游是HCV

7、 IRES部分有效序列和IFNγ效應(yīng)基因，即HBV-anti S/HCV core-IRES-IFNγ載體系統(tǒng)，簡(jiǎn)稱(chēng)為pcDNA3.1-SCⅡ載體系統(tǒng)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)HBV表達(dá)HBsAg時(shí)，此載體中HBV S基因反義序列轉(zhuǎn)錄的mRNA，可以與HBV S基因的mRNA結(jié)合，也就在HCV核心蛋白基因起始密碼子AUG前形成mRNA二聚體，抑制了HCV核心蛋白的表達(dá)，從而解除了HCV核心蛋白對(duì)HCV IRES的制約，IRES啟動(dòng)下游IFNγ基因表達(dá)增

8、強(qiáng)。這樣，受感染的肝細(xì)胞因表達(dá)HBsAg而自我同時(shí)表達(dá)IFNγ;而在正常無(wú)HBV S基因存在的細(xì)胞中，則不會(huì)介導(dǎo)IFNγ表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　通過(guò)PCR或酶切含目的片段質(zhì)粒的方法獲得的pcDNA3.1-SCⅡ載體中的四個(gè)基因片段:HBV anti S，HCV core，HCV IRES和人IFNγ基因分別和T載體連接后，經(jīng)PCR、酶切及測(cè)序鑒定后證實(shí)，獲得的四個(gè)基因片段均與Genbank上登錄的序列有97％以上的同源性。通

9、過(guò)亞克隆最終構(gòu)建的pcDNA3.1-SCⅡ載體，經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定表明，四個(gè)基因片段完全正確的插入了pcDNA3.1載體。
　　結(jié)論:
　　經(jīng)酶切和測(cè)序初步鑒定，成功構(gòu)建了pcDNA3.1-SCⅡ載體。
　　第二部分體外實(shí)驗(yàn)分析pcDNA3.1-SCⅡ載體中效應(yīng)基因人IFN-γ的細(xì)胞特異性表達(dá)
　　目的:
　　觀察構(gòu)建的pcDNA3.1-SCⅡ載體能否有效介導(dǎo)表達(dá)HBsAg的肝細(xì)胞特異性的人IFN-γ表達(dá)。

10、
　　方法:
　　(1)用雙酶切pEGFP-N1質(zhì)粒獲得的編碼綠色熒光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)的GFP基因替換pcDNA3.1-SCⅡ中的人IFN-γ基因，構(gòu)建出質(zhì)粒pcDNA3.1-SCIGFP。用脂質(zhì)體2000體外轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒pcDNA3.1-SCIGFP分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h后，熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)。同時(shí)構(gòu)建了pcDNA3.1-GF

11、P質(zhì)粒，分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染兩種細(xì)胞后，熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)，判斷pcDNA3.1介導(dǎo)的重組載體在兩種細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率。(2)用同樣方法將不同質(zhì)量（4μg、8μg和16μg）的pcDNA3.1-SCⅡ載體分別轉(zhuǎn)染HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h和96h的4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，ELISA檢測(cè)兩種細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的含量。轉(zhuǎn)染72h后，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR, R

12、T-PCR)法檢測(cè)兩種細(xì)胞中人IFN-γ在mRNA水平的表達(dá)。同時(shí)在轉(zhuǎn)染后72h，Western blot檢測(cè)兩種細(xì)胞內(nèi)IFN-γ蛋白的表達(dá)。(3)轉(zhuǎn)染72h后，用RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染了8μg陰性對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1-SCIGFP及8μg pcDNA3.1-SCⅡ質(zhì)粒的HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV S基因mRNA水平，以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HepG2.2.15細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了相同質(zhì)量空白pcDNA3.1載體的HepG2.2.15細(xì)胞做對(duì)照

13、，觀察構(gòu)建的pcDNA3.1介導(dǎo)的載體系統(tǒng)(pcDNA3.1-SCIGFP和pcDNA3.1-SCⅡ)對(duì)靶基因HBV S基因在mRNA水平的抑制作用。
　　結(jié)果:
　　(1)在相同的轉(zhuǎn)染效率下，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SCIGFP后可導(dǎo)致GFP在HepG2.2.15細(xì)胞中的高表達(dá)，而在HepG2細(xì)胞中幾乎沒(méi)有表達(dá)。(2)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SCⅡ72h后，Western blot結(jié)果顯示在不同的轉(zhuǎn)染劑量下，IFN-γ在Hep

14、G2.2.15細(xì)胞內(nèi)均呈陽(yáng)性表達(dá)，而在HepG2細(xì)胞內(nèi)均未檢測(cè)到有效表達(dá);RT-PCR結(jié)果顯示，IFN-γ在mRNA水平的表達(dá)也得到一致的結(jié)果，并且其mRNA表達(dá)量隨pcDNA3.1-SCⅡ轉(zhuǎn)染劑量的增加而增加。ELISA檢測(cè)兩種細(xì)胞上清中IFN-γ的表達(dá)得到的結(jié)果表明，在不同劑量和不同時(shí)間點(diǎn)下，IFN-γ在HepG2.2.15細(xì)胞上清中有效表達(dá)，而在HepG2細(xì)胞上清中表達(dá)水平很低。IFN-γ在HepG2.2.15細(xì)胞上清中的表達(dá)也具

15、有劑量效應(yīng)，同時(shí)IFN-γ的表達(dá)量在轉(zhuǎn)染后48h達(dá)到最高，在轉(zhuǎn)染后96h仍未見(jiàn)明顯下降。(3) RT-PCR檢測(cè)HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV S基因結(jié)果顯示，pcDNA3.1介導(dǎo)的載體系統(tǒng)（pcDNA3.1-SCIGFP和pcDNA3.1-SCⅡ）能夠有效抑制編碼HBsAg的S基因mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)論:
　　體外實(shí)驗(yàn)表明，pcDNA3.1-SCⅡ載體能夠使外源基因有效的在表達(dá)HBsAg的肝細(xì)胞中特異性表達(dá)，并能有

16、效抑制靶基因即編碼HBsAg的S基因mRNA表達(dá)水平。
　　第三部分 pcDNA3.1-SCⅡ載體體外抑制乙肝病毒復(fù)制與表達(dá)的研究
　　目的:
　　以HepG2.2.15細(xì)胞為靶細(xì)胞，觀察不同質(zhì)量pcDNA3.1-SCⅡ轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在不同時(shí)間pcDNA3.1-SCⅡ?qū)?xì)胞HBV基因復(fù)制和表達(dá)的作用，并觀察pcDNA3.1-SCⅡ?qū)?xì)胞凋亡的影響。
　　方法:
　　將不同質(zhì)量（4μg、8μg和16μg）的pc

17、DNA3.1-SCⅡ載體用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h和96h的4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞分泌上清中HBsAg和HBV e抗原(hepatitis B virus e antigen，HBeAg)含量;用熒光定量PCR(fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)方法檢測(cè)細(xì)胞分泌上清中HBV DNA含量;以上實(shí)驗(yàn)，均用未轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細(xì)胞作空白

18、對(duì)照、轉(zhuǎn)染了陰性對(duì)照質(zhì)粒(pcDNA3.1-SCIGFP)的HepG2.2.15細(xì)胞作為陰性對(duì)照及用10μmol/l拉米夫定處理的HepG2.2.15細(xì)胞作陽(yáng)性對(duì)照，觀察pcDNA3.1-SCⅡ?qū)?xì)胞上清中HBV復(fù)制與表達(dá)的影響，并觀察pcDNA3.1-SCⅡ作用的劑量-效應(yīng)關(guān)系。在轉(zhuǎn)染48h后，用Southern blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HBV DNA復(fù)制中間體的含量;觀察pcDNA3.1-SCⅡ?qū)?xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制的影響。在轉(zhuǎn)染96h后，

19、用Annexin V-FITC/PI法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，觀察pcDNA3.1-SCⅡ?qū)?xì)胞凋亡的影響。用拉米夫定處理的HepG2.2.15細(xì)胞組作陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細(xì)胞作陰性對(duì)照。
　　結(jié)果:
　　在轉(zhuǎn)染后4天里，不同質(zhì)量的pcDNA3.1-SCⅡ與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)照組相比均能顯著降低細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg、 HBeAg和HBV DNA的含量，且隨著轉(zhuǎn)染質(zhì)量的增加，其抑制作用也隨之增強(qiáng)(P＜0.05

20、);而轉(zhuǎn)染了陰性對(duì)照質(zhì)粒對(duì)照組與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。拉米夫定對(duì)細(xì)胞上清中HBVDNA抑制作用較強(qiáng)，但其抑制作用在第四天顯著下降，而pcDNA3.1-SCⅡ在第四天仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制HBV DNA作用;拉米夫定對(duì)細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg抑制作用較弱，其對(duì)HBeAg抑制作用介于4μg和8μg pcDNA3.1-SCⅡ?qū)BeAg的抑制作用之間、其對(duì)HBsAg抑制作用更弱，低于4μg pcDNA3.1-S

21、CⅡ?qū)BsAg的抑制作用。Southern blot法檢測(cè)也表明pcDNA3.1-SCⅡ能夠有效抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBV復(fù)制中間體含量，并且這種抑制作用也存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。我們觀察到pcDNA3.1-SCⅡ?qū)?xì)胞上清中HBsAg、 HBeAg和HBVDNA的抑制作用在轉(zhuǎn)染后48h達(dá)到最強(qiáng)，并且pcDNA3.1-SCⅡ?qū)BsAg的抑制作用比其對(duì)HBeAg和HBV DNA的抑制作用強(qiáng)。在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，與陰性對(duì)照組相比，拉