以乙肝病毒衣殼為載體的ps2-DTA對(duì)肝癌細(xì)胞特異性殺傷作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的: 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)具有嗜肝性，其外衣殼(hepatitisB virus envelope，HBVE)某些蛋白如前S1蛋白(pre S1)等與HBV的嗜肝性有關(guān)。本研究通過β-丙內(nèi)脂法制備乙肝病毒衣殼(HBVE)，以其作為白喉毒素A片斷基因(DTA)的基因轉(zhuǎn)移載體，觀察和探討以HBVE為載體的ps2-DTA在體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞中的特異表達(dá)情況及其對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用。 方法:

2、 1．采用PEG 8000病毒濃縮法從能持續(xù)產(chǎn)生HBV的Hep G2.2.15細(xì)胞上清液中提取HBV，用β-丙內(nèi)脂法制備HBVE。 2．用Elisa法、透射電鏡對(duì)HBV、HBVE、HBVDNA分別進(jìn)行表面蛋白保留情況及形態(tài)的檢測(cè)。 3．將HBVE包裹ps2-DTA制備成HBVE-DTA混合物，分別將HBVE-DTA及脂質(zhì)體-DTA轉(zhuǎn)染人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞株HepG2細(xì)胞，并將HBVE-DTA分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞及作

3、為對(duì)照的人肺腺癌細(xì)胞株A549、人皮膚成纖維細(xì)胞株FB，通過RT-PCR和細(xì)胞免疫組化染色檢測(cè)DTA的表達(dá)、TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡、臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)比較細(xì)胞存活率、細(xì)胞形態(tài)和生物化學(xué)等指標(biāo)觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷作用。 結(jié)果: 1．對(duì)HBV、HBVE、HBVE-GFP的檢測(cè)： (1)Elisa法、PCR法檢測(cè)結(jié)果可見，所制備的HBVE能保留HBV的表面蛋白HBsAg、pre S1。 (2)透射電鏡觀察三者均

4、為球形顆粒，HBV、HBVE-GFP中可見電子致密物，HBVE中未見電子致密物。 2．以乙肝病毒衣殼為載體的ps2-DTA轉(zhuǎn)染后觀測(cè)到： (1)在HepG2中，DTA在mRNA和蛋白水平的表達(dá)量顯著增加。 (2)在HepG2細(xì)胞分裂相少見、存活率低且生長(zhǎng)緩慢，對(duì)照細(xì)胞卻很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。 (3)HepG2細(xì)胞凋亡指數(shù)比對(duì)照細(xì)胞顯著增加。 結(jié)論: 1．我們用β-丙內(nèi)脂法成功地制備了HBVE