腸道缺血再灌注損傷中烏司他丁抗炎作用新靶點——自身消化假說.pdf

1、腸道缺血再灌注損傷作為一種高并發(fā)癥和死亡率的臨床事件，早在60年前就引起了許多學者的關注。腸道局部的缺血再灌注損傷，可以導致全身炎癥反應及遠隔器官功能障礙已在大量實驗研究及臨床觀察中得到證實，但是其作用機制至今未明。繼倍受爭議的腸道細菌-內毒素易位學說后，Schmid-Sch(o)nbeinGW提出了腸道自身消化學說，他們認為胰蛋白酶在炎癥和多器官功能障礙進程中起著非常關鍵的作用。當機體遭受感染、創(chuàng)傷、休克等打擊時，腸腔中的胰蛋白酶可以

2、透過缺血的腸道粘膜屏障進入粘膜下層基質中引起腸道組織自身消化并介導生成大量炎癥介質。因此，通過抑制缺血腸道中的蛋白酶活性，可能對控制炎癥和休克的進展有關鍵作用。
　　 烏司他丁(UTI)是從人尿中提取的胰蛋白酶抑制劑，對胰蛋白酶、α-糜蛋白酶等絲氨酸蛋白酶及粒細胞彈性蛋白酶、透明質酸酶、巰基酶、纖溶酶等多種酶有抑制作用。靜脈注射烏司他丁的抗炎作用已經在腸道缺血再灌注損傷、感染性休克及失血性休克等休克模型中得到證實，并被認為其抗炎

3、作用有可能與其具有穩(wěn)定溶酶體膜，抑制溶酶體酶的釋放，抑制心肌抑制因子(MDF)產生，清除氧自由基及抑制炎癥介質釋放的作用有關。根據自身消化理論，我們認為烏司他丁的抗炎作用有可能與其最重要的功能——抑制胰蛋白酶活性有關。本實驗旨在驗證自身消化假說及探討烏司他丁抗炎作用的機制。
　　 1、材料和方法
　　 1.1動物及分組
　　 48只健康清潔級雄性WISTAR大鼠（由南方醫(yī)科大學動物實驗中心提供），體重200～25

4、0g，術前禁食禁水8小時。隨機分成四組，A組:對照組（sham group）;B組:腸道缺血再灌注但不灌洗腸道組(SMAO group);C組:腸道缺血再灌注，用生理鹽水灌洗腸道組(SMAO+NS group);D:腸道缺血再灌注，用烏司他丁灌洗腸道組(SMAO+UTI group)。每組12只，各組大鼠體重無明顯差異。
　　 1.2實驗程序
　　 秤取健康WISTAR大鼠體重，以3％戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻

5、醉成功后，將大鼠仰臥位固定于實驗手術板(37℃-38℃)上，于左側腹股溝處備皮消毒，行左側股動脈、股靜脈游離術。游離好動靜脈后，以PE50動脈置管分別行動、靜脈穿刺術置管術，股動脈套管經三通閥與動脈套裝相連，然后連接于血壓監(jiān)護儀，監(jiān)測平均動脈壓變化。股靜脈套管與三通閥和2ml注射器相連，用于靜脈補液。置管術完成后，于上腹部正中備皮、消毒，打開腹腔，分離腸系膜上動脈，在動脈根部環(huán)繞一根絲線(3-0)，絲線兩頭均穿過一個約1cm長的軟管管芯

6、，通過拉緊絲線阻斷腸系膜上動脈血流制作腸道缺血再灌注損傷模型。分別于十二指腸上端及回腸末端插入軟管用絲線結扎，形成循環(huán)通路，用于腸道灌洗。
　　 A組動物只進行手術操作; B組、C組和D組，通過阻斷腸系膜上動脈血流造成腸道缺血100分鐘后恢復動脈血流;C組和D組分別于缺血前(40ml)，再灌注后20分鐘及60分鐘(30ml)時用含或者不含UTI(100U/ml)的鹽水緩慢灌洗腸道。各組隨機取6只大鼠進行生存時間觀察，在再灌注后8

7、0min拔除動脈及腸道插管，小心結扎漏口及縫合傷口，觀察其生存時間。各組其余6只大鼠收集標本進行檢測，收集C組和D組第二次及第三次腸道灌洗液，取其中5ml離心(500 g×5 min)，取上層清液2ml于-70℃保存以備檢測蛋白酶活性。再灌注后80分鐘，抽取動脈血2ml（抽血后經靜脈補充等量生理鹽水），含肝素10 U/ml，其中1ml用于檢測白細胞表面CD11b表達水平，另外1ml離心（500 g×5min）后，取血漿于-70℃保存以備

8、檢測腫瘤壞死因子α及白介素1水平。在再灌注后80min處死大鼠，收集小腸組織進行組織病理檢測。
　　 1.3指標檢測
　　 1.3.1腸道缺血再灌注過程中平均動脈壓(MAP)變化通過彩色插件式監(jiān)護儀（美國惠普醫(yī)療器械公司，型號M1166A64S）觀察并記錄大鼠腸道缺血再灌注過程中MAP的變化。
　　 1.3.2生存時間當大鼠心臟停止跳動，未經處理5min沒有變化，確定為死亡。
　　 1.3.3白細胞表面粘

9、附分子CD11b表達水平試管編號，加入所需熒光標記單抗CD11b-FITC（英國SEROTEC公司產品），同時加一管Mouse IgG1-FITC作為同型對照;每管加入標本106個細胞，暗處，室溫(10-25℃)放15分鐘;加入溶血液2ml，暗處放10分鐘;離心1000轉/5分鐘，去上懸液，加入PBS2ml混勻;離心1000轉/5分鐘，去上清，加0.5ml1％甲醛固定液，待上FACSCatoⅡ型流式細胞儀檢測，用FACS DIVA軟件分

10、析報告，數據用百分數表示。
　　 1.3.4腫瘤壞死因子α及白介素1水平檢測使用R&D公司提供的大鼠TNF-α和IL-1試劑盒，采用酶聯免疫吸附法（ELISA法）測定血漿TNF-α和IL-1水平。劑盒中使用純化抗體包被在微孔板內使其充分吸附在微孔壁上制成固相載體。試驗過程中標準品、酶標記物和待測樣品共同競爭包被在微孔上的固相抗體的定量結合位點。通過溫育反應使其充分結合在微孔壁上形成標記復合物。反應過后沖洗掉未結合的部分再加入底物

11、反應底物在酶的作用下變?yōu)樗{色并在酸的作用下轉化為最終的黃色。通過使用酶標儀讀取吸光度值來繪制出標準曲線并在標準曲線上反算出待測樣品的濃度。
　　 1.3.5腸液蛋白酶活性檢測用Enz-Chek Protease Assay Kits依據其說明書檢測腸液蛋白酶活性。將試劑盒中提供的純蛋白酶配成不同濃度梯度的溶液并檢測其活性以制備標準曲線，將20μl樣本與80μ(l)X消化液及100μl含蛋白底物的工作液放入96孔板中置于37℃培養(yǎng)

12、箱避光孵育60min，孵育后用酶標儀檢測熒光活性。根據標準曲線將熒光活性(FU)轉換成蛋白酶濃度(μg/ml).
　　 1.3.6腸道組織病理切片處死大樹后后在距屈氏韌帶5cm處取空腸組織4cm，用0.9％NaCl和0.25％枸櫞酸鈉溶液反復沖洗各4次，取中間2 cm組織4％甲醛固定，經脫水、浸蠟、包埋、切片、染色后制成病理切片，光學顯微鏡下觀察。
　　 1.4統計學處理
　　 采用SPSS13.0統計軟件進行處

13、理，計量資料均以(x)±SD表示，大鼠平均動脈壓采用重復測量數據的方差分析;大鼠生存時間、中性粒細胞CD11b的表達、TNF-α及IL-1水平的比較均采用完全隨機設計多樣本比較的方差分析，采用LSD法進行多重比較;腸道蛋白酶活性的比較用兩樣本T檢驗;P＜0.05為差異有統計學意義。
　　 2、結果
　　 2.1生存時間分析
　　 假手術組大鼠生存時間均大于24小時，MSAO組大鼠平均生存時間為0.48小時，與SM

14、AO+NS組（2.1小時）及SMAO+UTI組（6.4小時）相比明顯縮短(P＜0.05).SMAO+UTI組生存時間明顯長于SMAO+NS組(P＜0.01).
　　 2.2腸道缺血再灌注過程中血壓變化情況
　　 阻斷腸系膜上動脈血流時，各組大鼠血壓均立即明顯升高(約20～28mmHg)，再灌注后血壓均立即顯著下降(約40～58mmHg)。SMAO組在灌注后血壓下降最明顯，再灌注后第一個時間點血壓明顯低于其他三組，之后血壓

15、持續(xù)性下降，SMAO+NS組與SMAO+UTI組的低血壓均有一定程度的緩解。SMAO+UTI組血壓在再灌注30分鐘后各個時間點血壓均明顯高于SMAO+NS組。
　　 2.3中性粒細胞表面粘附分子CD11b(PMN CD11b)的表達
　　 炎癥反應早期，中性粒細胞表面粘附分子CD11b表達增加，以介導中性粒細胞的粘附和聚集。因此我們測定PMN CD11b的表達水平以反應炎癥反應水平。SMAO+NS組的PMN CD11b的

16、表達水平明顯高于SMAO+UTI組(P＜0.05)。表明腸道灌注烏司他丁可以在炎癥的早期降低炎癥反應水平。
　　 2.4 TNF-α和IL-1水平
　　 TNF-α和IL-1是白細胞被激活后釋放的主要促炎因子。SMAO+UTI組TNF-α和IL-1水平明顯低于SMAO+NS組(P＜0.05)。
　　 2.5腸道蛋白酶活性
　　 用等量的生理鹽水灌洗腸道，烏司他丁使SMAO+UTI組腸液中蛋白酶活性(168

17、.09±16.22μg/ml)明顯降低，與SMAO+NS組(282.85±13.90μg/ml)比較有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 2.6腸道組織病理變化
　　 肉眼觀察MSAO組大鼠小腸大部分缺血壞死，呈暗紅色;SMAO+NS組片狀壞死;SMAO+UTI組點狀壞死，大部分為粉紅色正常組織。光鏡下觀察SMAO+NS組組絨毛斷裂，壞死，大量炎性細胞浸潤。SMAO+UTI組與對照組比較也表現為炎性細胞浸潤，程度較SMA

18、O+NS組輕，未見絨毛斷裂現象。
　　 3.結論
　　 1、腸道內灌注烏司他丁可以延緩腸缺血再灌注損傷大鼠休克后血壓下降過程，最終延長存活時間。
　　 2、烏司他丁作為蛋白酶抑制劑，通過腸道內灌注后，可以降低腸缺血再灌注損傷大鼠休克后血漿炎癥反應水平，明顯降低PMN CD11b、腫瘤壞死因子α和白細胞介素1水平。
　　 3、通過腸道灌洗和腸道內灌注烏司他丁，可以降低腸道內的蛋白酶含量，減緩蛋白酶對腸道組織