樹突狀細胞在干擾素聯(lián)合供體淋巴細胞輸注治療移植后白血病復發(fā)中增強抗白血病效應機制的體外研究.pdf

1、目的:1.建立與細胞因子干擾素-α(IFN-α)活化的供體淋巴細胞輸注(aDLI)相對應的IFN-樹突狀細胞(IFN-DC)以及傳統(tǒng)的白介素-4-DC(IL-4-DC)兩組DC體外培養(yǎng)體系;2.比較分析兩個DC培養(yǎng)體系中DC生物學特征以及功能差異;3.初步闡明aDLI中IFN-α誘導產(chǎn)生的IFN-DC與aDLI抗白血病效應增強之間的相關(guān)性。
　　方法:1、兩組體外DC(即IFN-DC與IL-4-DC)的培養(yǎng):采集正常供體粒系-細胞

2、集落刺激因子(G-CSF)動員后的外周血干細胞(PBSC),Ficoll法分離獲得外周血單個核細胞(PBMC)。磁珠分選獲得CD14+單核細胞,根據(jù)不同培養(yǎng)體系分成兩組:對照組(IL-4-DC組):粒系巨核系-細胞集落刺激因子(GM-CSF)聯(lián)合白介素-4(IL-4)誘導CD14+單核細胞分化成DC,誘導第5天加入腫瘤壞死因子-α(TNF-α)促進DC的成熟,并于第7天收獲IL-4-DC;實驗組(IFN-DC組):GM-CSF聯(lián)合IFN

3、-α誘導CD14+單核細胞分化成DC,并于第3天收獲IFN-DC。2、比較兩組DC的生物學特征:通過流式FCM檢測兩組DC免疫表型(CD14,CD83,CD56,CD11c,CD123,CD209,CD40,CD80,CD86,HLA-DR);混合淋巴細胞反應(MLR)測定DC刺激淋巴細胞增殖能力;Real Time RT-PCR檢測兩組DC溶酶相關(guān)性膜蛋白(DCLAMP)mRNA的表達情況;采用transwell小室法測定兩組DC的遷

4、移能力,Real Time RT-PCR檢測趨化因子受體CCR7 mRNA水平。3、IFN-DC的功能研究:a.IFN-DC的直接細胞殺傷效應:將K562細胞與IFN-DC混合培養(yǎng)后,采用LDH釋放試驗,測IFN-DC的直接細胞殺傷率％;b.IFN-DC激活淋巴細胞引發(fā)的特異性的細胞殺傷效應:制備SHI-1細胞株凍融抗原并負載兩組培養(yǎng)體系DC,用抗原負載DC刺激供體T細胞,再與SHI-1細胞株混合培養(yǎng),采用LDH釋放試驗,測T細胞的細胞

5、殺傷率％。
　　結(jié)果:1.經(jīng)GM-CSF/IFN-α以及GM-CSF/IL-4/TNF-α誘導分化的DC具有明顯的細胞突起,具備典型DC形態(tài);2.初步流式結(jié)果顯示IFN-DC以及IL-4-DC較誘導前CD14表達量迅速下調(diào),同時表達較高CD83,CD11c,CD123,CD209,CD40,CD80, CD86,HLA-DR;3.IFN-DC與IL-4-DC是兩組不同的DC,二者免疫表型存在差異:CD14(81.55±1.23％v

6、s6.80±1.80％,p=0.000),CD209(44.08±5.02％vs95.02±5.76％, p=0.002), CD40(94.29±3.69％vs70.53±2.43％, p=0.001), CD80(30.67±3.82％vs83.38±12.71％,p=0.005),CD86(85.34±5.25％vs70.16±8.25％,p=0.023);4.Transwell小室實驗結(jié)果表明,IFN-DC較IL-4-DC的趨化

7、能力更強,遷移指數(shù)(3.55±0.45) vs(2.53±0.18),p<0.05,進一步Real Time RT-PCR結(jié)果表明IFN-DC的CCR7 mRNA表達量較IL-4-DC高,p<0.05;5.Real Time RT-PCR結(jié)果表明IFN-DC的DC-LAMP mRNA表達量也較IL-4-DC高,p<0.05;6.混合淋巴反應(MLR)實驗結(jié)果表明在各比例條件下IFN-DC刺激淋巴細胞增殖的能力較IL-4-DC刺激淋巴細胞

8、增殖的能力有增強趨勢;7.乳酸脫氫酶釋放試驗表明兩組DC負載凍融抗原刺激自體淋巴細胞后均有明顯的細胞殺傷效應。
　　結(jié)論:1.成功建立了IFN-DC以及IL-4-DC兩個體外DC培養(yǎng)體系;2.IFN-DC與IL-4-DC是兩組不同群體的DC;3.IFN-DC較IL-4-DC有更強的遷移能力以及抗原提呈能力;4.各比例條件下IFN-DC刺激淋巴細胞增殖的能力較IL-4-DC刺激淋巴細胞增殖的能力有增強趨勢,同時抗原負載的IFN-DC