我國長期抗病毒治療失敗艾滋病患者基因型耐藥和表型耐藥研究.pdf

1、目的：
　　艾滋病是威脅人類健康的重大傳染性疾病，據(jù)估計中國已有艾滋病病毒感染者和艾滋病患者74萬，其中艾滋病患者10.5萬，艾滋病流行和防治形勢依然嚴(yán)峻。艾滋病尚無治愈方法，高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（Highly Active AntiretroviralTherapy, HAART）是目前最有效治療艾滋病并控制HIV傳播的方法。然而，隨著HAART的廣泛應(yīng)用，新的耐藥變異在不斷出現(xiàn)，HIV耐藥日趨嚴(yán)重，已成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生熱點

2、問題。
　　南非、烏干達(dá)及巴西等地的研究發(fā)現(xiàn)， HAART治療病毒學(xué)失敗的HIV-1感染者出現(xiàn)耐藥突變的比例在86％以上，耐藥突變位點隨著治療時間延長而逐漸增多。我國在2002年啟動了艾滋病免費抗病毒治療，隨著我國免費抗病毒治療的推廣，全國接受抗病毒治療的艾滋病人累計已接近10萬人，隨著治療時間延長，耐藥率也在逐年增加，但目前報道的多為治療時間在2-3年內(nèi)的耐藥研究，對于治療時間3年以上的治療失敗患者的耐藥情況尚無報道。在我國長期

3、服用一線抗病毒治療方案的艾滋病人治療失敗后，耐藥突變率是否仍持續(xù)上升？與治療時間短的患者相比較是否出現(xiàn)更多的耐藥突變位點？更多耐藥位點的出現(xiàn)能否用現(xiàn)有的耐藥數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)進(jìn)行解釋？這些問題都尚無報道。
　　HIV-1耐藥性檢測方法主要有基因型檢測和表型檢測兩種?；蛐蜋z測是目前全球普遍采用的方法，它通過擴(kuò)增病毒的耐藥相關(guān)基因序列后提交到斯坦福HIV耐藥數(shù)據(jù)庫判斷病毒的耐藥性。這種方法的優(yōu)點是簡單、快速、費用低，缺點是僅是一種間接、定性

4、判斷耐藥性的方法，是利用耐藥數(shù)據(jù)庫對耐藥表型的一種預(yù)測。表型耐藥檢測通過測定不同藥物濃度下病毒的復(fù)制能力來檢測病毒對藥物的敏感性，能定量進(jìn)行藥物敏感性判斷，是對病毒耐藥性進(jìn)行分析的標(biāo)準(zhǔn)方法。該方法檢測的是不同耐藥突變相互作用的凈效應(yīng)，能夠直接判斷毒株的耐藥性，可以彌補基因型耐藥檢測的不足，提供更為可靠的耐藥信息?；蛐湍退幣c表型耐藥檢測結(jié)果不一致時，國際上通常以表型耐藥檢測結(jié)果為準(zhǔn)。以往都用活病毒進(jìn)行表型耐藥檢測，由于活病毒表型耐藥檢測

5、耗時、費力、實驗室條件要求過高，目前國外正在開發(fā)假病毒表型耐藥檢測方法，已逐漸發(fā)展成為國際普遍采用的表型耐藥檢測方法，國內(nèi)尚無應(yīng)用假病毒對HAART治療失敗人群進(jìn)行表型耐藥的研究報道。
　　綜上所述，本研究選取長期服用一線抗病毒治療方案后病毒學(xué)失敗的患者，進(jìn)行基因型耐藥檢測，明確該人群耐藥變異情況;建立假病毒表型耐藥檢測方法，對上述病例進(jìn)行假病毒表型耐藥檢測，與基因型耐藥檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析;進(jìn)一步應(yīng)用活病毒表型耐藥檢測方法驗證假

6、病毒表型耐藥方法的有效性，以期尋找適合長期抗病毒治療后病毒學(xué)失敗患者的耐藥檢測方法。
　　方法：
　　1、研究對象
　　研究對象入選標(biāo)準(zhǔn):接受HAART治療3年以上，并根據(jù)《艾滋病診療指南》中病毒學(xué)失敗的標(biāo)準(zhǔn)，同時符合下列任一條件者即符合入選標(biāo)準(zhǔn):
　　(1)經(jīng)HAART后血漿中病毒載量沒有降至“測不出(＜400copies/ml)”的水平;
　　(2)血漿中病毒載量經(jīng)HAART治療已達(dá)到“測不出(＜400

7、copies/ml)”的水平后又出現(xiàn)明顯反跳;
　　選取河南及遼寧地區(qū)27名長期治療失敗病例，按照知情同意的原則，以統(tǒng)一的問卷逐一進(jìn)行咨詢訪談，在采集流行病學(xué)資料的同時對病人進(jìn)行臨床體檢并以EDTA-3K抗凝管采集HIV-1感染者外周靜脈血?？鼓?4小時內(nèi)測定CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)，全血經(jīng)常規(guī)離心分離血漿，分裝后-80℃凍存用于病毒載量和基因型耐藥的測定。
　　經(jīng)構(gòu)建進(jìn)化樹分析，2例取自遼寧的B'亞型與河南的B'亞型遺傳距

8、離接近，且存在多個耐藥突變位點，其表型耐藥檢測結(jié)果可適用于河南B'亞型病例的表型耐藥分析。
　　2、CD4+T細(xì)胞絕對值的檢測
　　應(yīng)用美國BD公司的流式細(xì)胞儀(FACS CALIBUR)測定CD4+、CD8+、CD3+T淋巴細(xì)胞絕對值。將20μl CD4/CD8/CD3 TRITEST試劑加入CD4絕對計數(shù)管，加入50μl抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血素450μl，室溫避光15min，F(xiàn)ACSMULTISET軟件

9、檢測并進(jìn)行自動分析。
　　3、病毒載量測定
　　以200μl血漿采用標(biāo)準(zhǔn)版模板制備法提取RNA，采用Roche公司HIV-1Monitor(1).5 commercial kit在COBASAMPLICOR自動載量儀上以RT-PCR方法測定病毒載量。檢測范圍為400-750000copies/ml。
　　4、病毒核酸提取
　　以140μl血漿提取病毒基因組RNA，按照QIAamp Viral RNA Mini K

10、it說明書步驟提取RNA，提取物溶于60μl洗脫液中。
　　5、耐藥株基因變異的測定
　　RNA逆轉(zhuǎn)錄PCR和套式PCR方法，以外側(cè)引物對:yp-1(5'-GCAAGAGTTTTGGCTGAAGCAATGAG-3' HIV-1 HXB21867-1892nt)和yp-2(5'-CCTTGCCCCTGCTTCTGTATTTCTGC-3' HIV-1HXB23528-3553nt);內(nèi)側(cè)引物對:yp-3(5'-TGCAGGGCC

11、CCTAGGAAAAAGGGCTG-3' HIV-1HXB22002-2027nt)和yp-4(5'-CATGTACCGGTTCTTTTAGAATCTCTCTGTT-3' HIV-1 HXB23465-3495nt)用于擴(kuò)增HIV-1蛋白酶1-99氨基酸和逆轉(zhuǎn)錄酶1-240氨基酸的編碼區(qū)序列。
　　6、PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化
　　取終產(chǎn)物5μl進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像后與marker比對，確認(rèn)所需片段，用QIAquic

12、k Gel Extraction Kit試劑盒純化基因片段。
　　7、病毒分離
　　感染者PBMC用Ficoll-Hypaque密度梯度分層液分離，并與至少兩個正常人的經(jīng)植物凝集素(PHA)(5μg/ml)刺激2-3天的PBMC共培養(yǎng)法復(fù)制病毒。每3-4天換液1次，每7天添加1次經(jīng)PHA刺激生長3天的正常人PBMC。定期對培養(yǎng)細(xì)胞上清中的病毒p24抗原含量進(jìn)行檢測，按照說明書操作，對檢測陽性的病毒進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。所分離的病毒凍

13、存于液氮中備用。
　　8、TA克隆
　　擴(kuò)增的pol基因1494bp片段插入克隆載體pMD-18載體，轉(zhuǎn)入化學(xué)感受態(tài)菌DH5α擴(kuò)大培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙脫氧終止法測序。
　　9、帶有患者POL基因片段的嵌合質(zhì)粒構(gòu)建
　　取含患者來源的pol基因片段的TA克隆質(zhì)粒，進(jìn)行ApaⅠ/AgeⅠ雙酶切，同樣將pNL4-3-dE-EGFP質(zhì)粒經(jīng)雙酶切獲得缺失gag-pol區(qū)段目標(biāo)片段的空載體。用T4DNA連接酶連接酶

14、切產(chǎn)物，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α、涂板和挑選克隆增菌實驗，從增菌液中提取重組質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行測序鑒定。
　　10、功能性假病毒的獲得
　　將帶有病人HIV-1 pol基因片段的重組質(zhì)粒pNL4-3-dE-GFP和pVSV-G質(zhì)粒通過Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，37℃培養(yǎng)48小時，吸出細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清，經(jīng)0.45μm濾器過濾去掉細(xì)胞碎片即獲得假病毒。
　　11、假病毒及活病毒耐藥性檢測
　　

15、將梯度稀釋的藥物在假病毒或真病毒感染受體細(xì)胞TZM-bl時加入到培養(yǎng)液中，干擾病毒的感染過程。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，利用熒光素酶檢測系統(tǒng)測定每孔的熒光信號值以檢測耐藥表型。
　　12、耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)和耐藥數(shù)據(jù)分析:
　　基因型耐藥判定標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)斯坦福耐藥網(wǎng)站評分系統(tǒng)進(jìn)行基因型耐藥藥物耐受程度評估，0-9分:敏感(S);10-14分:潛在耐藥(P);15-29分:低度耐藥(L);30-59分:中度耐藥(I);＞60分，高度耐藥(H

16、)。
　　表型耐藥判定標(biāo)準(zhǔn):臨床病毒IC50與野生株IC50相比，根據(jù)倍數(shù)變化(FoldChange，F(xiàn)C)判斷臨床病毒耐藥水平。根據(jù)IC50倍數(shù)變化將病毒耐藥水平分為敏感(S∶ FC＜4倍)和耐藥(R)兩類，耐藥又分為中度耐藥(I∶FC4-10倍)和高度耐藥(H∶FC＞10倍)。
　　所有藥物濃度均轉(zhuǎn)化為log10濃度值，每一濃度樣品孔均計算平均RLU值，計算每一濃度樣品熒光抑制率，計算公式:
　　藥物抑制率(％)=

17、[1-（加藥孔發(fā)光值-細(xì)胞對照孔發(fā)光值）/（病毒對照孔發(fā)光值-細(xì)胞對照孔發(fā)光值）]×100％。
　　數(shù)據(jù)分析利用Graphpad Prism V5.0軟件，采用非線性回歸分析中四參數(shù)S型劑量方程分析每種藥物的IC50值。
　　13、統(tǒng)計學(xué)分析:
　　所有資料采用SPSS11.5軟件分析，數(shù)據(jù)處理成均值±標(biāo)準(zhǔn)差。統(tǒng)計概率采用四格表精確概率檢驗，p＜0.05時有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、長期抗病毒治療失

18、敗人群基因型耐藥研究結(jié)果
　　1、研究對象的人口學(xué)、病毒學(xué)和免疫學(xué)特征:
　　27例治療失敗病例中男性16例，占59.3％，女性11例，占40.7％;平均年齡44±7歲。研究對象全部為漢族。HIV-1均為B'亞型。至檢測時，平均服藥時間為60±10月。27例患者的CD4計數(shù)為241±155個/μl，病毒載量為4.4±0.8 log10copies/ml。
　　2、耐藥相關(guān)位點:
　　27例患者100％檢測出NNR

19、TI耐藥相關(guān)突變，突變位點及頻率分別為K103N(40.7％,11/27)、Y181C(25.9％,7/27)、G190A(22.2％,6/27)、K101E、 K238T(11.1％，3/27)和Y188L(7.4％，2/27)。其中23例(85.2％，23/27)檢測出NRTI耐藥相關(guān)突變，突變位點為M41L(59.3％，16/27)、T215Y(44.4％，12/27)、L210W(40.7％,11/27)、K70R(33.3％,

20、9/27)、M184V(29.6％,8/27)、D67N(25.9％,7/27)以及L74V(22.2％，6/27)。與治療時間在3年以內(nèi)的患者相比，檢測到未見文獻(xiàn)報道的K219N、V90I、V106I和H221C耐藥突變位點。27例患者均未檢出PI耐藥相關(guān)主要突變，其中11例(40.7％，11/27)檢測出PI耐藥相關(guān)次級突變，其中以A71T(81.8％，9/11)出現(xiàn)的頻率最高。
　　3、對抗病毒藥物的敏感性:
　　對N

21、NRTIs呈高水平耐藥，對NVP和EFV的耐藥率高達(dá)96.3％，對其他幾種納入免費抗病毒治療的NRTIs耐藥率分別為:3TC:66.7％，AZT:77.8％, d4T:77.8％, ddI:81.5％。
　　二、假病毒表型耐藥研究結(jié)果
　　1、重組質(zhì)粒測序結(jié)果:
　　27例病例均獲得重組質(zhì)粒。用重組質(zhì)粒與pVSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，有16例獲得具有感染性的假病毒。對16例重組質(zhì)粒測序，有2例患者質(zhì)粒在逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)

22、測序結(jié)果與PCR產(chǎn)物測序結(jié)果略有差異，但提交斯坦福耐藥數(shù)據(jù)庫后耐藥預(yù)測無差異。對質(zhì)粒測序結(jié)果與PCR產(chǎn)物測序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物與重組質(zhì)粒遺傳距離非常接近。
　　2、基因型耐藥檢測結(jié)果:
　　100％(16/16)患者對至少一種逆轉(zhuǎn)錄酶藥物耐藥，其中93.8％(15/16)對NNRTI耐藥，對NRTI的耐藥率分別為:3TC:56.3％，AZT:75.0％，d4T:75.0％,ddI:75.0％。
　　3、

23、用假病毒表型耐藥方法檢測結(jié)果:
　　100％(16/16)患者對至少一種逆轉(zhuǎn)錄酶藥物耐藥，其中87.5％(14/16)對NNRTI耐藥，對NRTI的耐藥率分別為:3TC:93.8％，AZT:68.8％，d4T:43.8％，ddI:56.2％。
　　4、表型耐藥檢測與基因型耐藥檢測的關(guān)系:
　　通過比較表型和基因型耐藥檢測結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，對于ddI、3TC、d4T、AZT和EFV五種藥物，分別有50％(8/16)、37.5

24、％(6/16)、31.3％(5/16)、18.8％(3/16)和18.8％(3/16)的基因型和表型耐藥結(jié)果不一致。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。對于3TC，6例均為基因型敏感而表型耐藥。對于d4T，5例均為基因型耐藥而表型敏感。對于AZT和EFV，分別有2例為基因型耐藥而表型敏感，另有1例為基因型敏感而表型耐藥。對于ddI，有5例為基因型耐藥而表型敏感，而另外3例為基因型敏感而表型耐藥。
　　三、活病毒表型耐藥研究結(jié)果<

25、br>　　1、基因型耐藥結(jié)果:
　　4例患者均檢出NRTI或NNRTI耐藥突變。300149對AZT、d4T和EFV耐藥，對3TC和ddI敏感;300180對AZT、d4T、3TC和ddI敏感，對EFV耐藥;300130對AZT、ddI和d4T敏感，對3TC和EFV耐藥;300494對ddI、d4T、AZT、3TC和EFV均耐藥。
　　2、實驗室適應(yīng)毒株表型耐藥檢測:
　　用實驗室適應(yīng)毒株SF33來檢測TZM-bl細(xì)胞

26、方法的敏感性，每次實驗重復(fù)2次，利用Graphpad Prism V5.0軟件計算每種藥物對病毒的IC50。AZT、ddI、d4T、ddI、3TC以及EFV對SF33毒株的IC50分別為(0.004±0.001)μM、(2.66±0.08)μM、(0.139±0.037)μM、(0.392±0.008)μM、(0.078±0.007)μM。
　　3、病毒株的表型耐藥結(jié)果:
　　300149和300180對AZT、d4T和3T

27、C敏感，對ddI和EFV耐藥;300130對AZT和d4T敏感，對ddI、3TC和EFV耐藥;300494對ddI和d4T敏感，對AZT、3TC和EFV耐藥。
　　4、活病毒表型耐藥與基因型耐藥結(jié)果比較:
　　ddI:100％不一致，d4T:50％不一致，AZT:25％不一致，EFV和3TC的結(jié)果無不一致。
　　5、活病毒與假病毒表型耐藥性結(jié)果比較:
　　分別檢測兩株病毒對五種藥物的表型耐藥，共得到10個結(jié)果，其

28、中9個結(jié)果在耐藥解釋及耐藥程度上均高度一致，僅300494毒株對于AZT的耐藥結(jié)果存在程度上的差異（假病毒方法為中度耐藥，而活病毒方法為高度耐藥）。
　　結(jié)論：
　　1、我國抗病毒治療平均5年以上病毒學(xué)失敗艾滋病患者耐藥突變率為100％，顯著高于國內(nèi)治療時間在3年以內(nèi)的人群的耐藥突變率。該人群對NNRTI和NRTI均呈高水平耐藥。出現(xiàn)頻率較高的耐藥突變?yōu)镸41 L(59.3％)、T215Y(44.4％)、L210W(40.7

29、％)、K103N(40.7％)和K70R(33.3％)。與國內(nèi)治療時間在3年以內(nèi)的患者相比，檢測到未見文獻(xiàn)報道的K219N、V90I、V106I和H221C耐藥突變位點。未發(fā)現(xiàn)蛋白酶抑制劑主要耐藥突變。
　　2、在國內(nèi)首次應(yīng)用假病毒的方法對我國長期抗病毒治療后病毒學(xué)失敗艾滋病患者共16株病毒的表型耐藥進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)基因型耐藥檢測與假病毒表型耐藥檢測存在不一致的結(jié)果。現(xiàn)有的斯坦福耐藥數(shù)據(jù)庫不能對我國長期抗病毒治療失敗患者的基因型耐