應(yīng)用深度測(cè)序分析NRTI類交叉耐藥對(duì)河南長(zhǎng)期二線抗病毒治療失敗者療效影響的研究.pdf

1、目的：獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)簡(jiǎn)稱艾滋病，是由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)引起的一種危害性極大的傳染病，目前尚無(wú)法徹底根治。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（Highly active antiretroviral therapy，HAART）是目前世界范圍內(nèi)公認(rèn)的對(duì)抗艾滋病最有效的療法。我國(guó)從2003年在全國(guó)范圍

2、內(nèi)廣泛推行一線抗艾滋病藥物，推薦采用的一線治療方案為2種核苷類抑制劑(Nucleotide Analogue ReverseTranscriptase Inhibitors，NRTIs)+1種非核苷類抑制劑(Nonnucleotide AnalogueReverse Transcriptase Inhibitors，NNRTIs)，具體用藥情況為齊多夫定/司他夫定(Zidovudine/Stavudine，AZT/D4T)+去羥基苷/拉

3、米夫定(Didanosine/Lamivudine，DDI/3TC)+依法韋侖/奈韋拉平(Efavirenz/Nevirapine，EFV/NVP)。但同發(fā)達(dá)國(guó)家相對(duì)豐富的藥物資源相比，我國(guó)一線所使用的抗病毒治療藥物較為單一，患者出現(xiàn)耐藥后很難及時(shí)更換藥物，這就導(dǎo)致了高耐藥率的產(chǎn)生。面對(duì)一線藥物嚴(yán)峻的耐藥形式，我國(guó)于2009年4月以河南省為試點(diǎn)開展二線抗病毒治療，二線抗病毒治療方案主要是1種蛋白酶抑制劑(Protease Inhibit

4、ors，PIs)+2種核苷類抑制劑(NRTIs)，即拉米夫定(3TC)+替諾福韋(Tenofovir，TDF)+克立芝(Lopinavir/ritonavir, Lpv/r)。截止目前，二線抗病毒治療方案已在我國(guó)實(shí)行了6年。從國(guó)內(nèi)目前現(xiàn)有的二線報(bào)道來看，換藥后12個(gè)月內(nèi)患者的CD4+T淋巴細(xì)胞較患者換藥前有所增長(zhǎng)，病毒載量有所下降，短期內(nèi)治療效果良好。但尚缺乏針對(duì)更換二線藥物后長(zhǎng)期治療效果的相關(guān)報(bào)道。本研究隊(duì)列的前期群體水平長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)結(jié)果

5、顯示195人更換藥物前病毒抑制率為34.6％。更換二線抗病毒藥物6個(gè)月后，隨訪157例，病毒載量抑制率升高到61.8％;隨訪12個(gè)月后病毒抑制率高達(dá)71.2％;隨訪第48個(gè)月的病毒抑制率為75.3％，且患者整體的CD4+T水平較換藥前有所升高，病毒載量水平較換藥前有所下降。然而仍舊存在少數(shù)患者經(jīng)長(zhǎng)期二線治療但病毒學(xué)失敗(VL＞400copies/ml)，且常規(guī)基因型耐藥檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)耐藥。排除依從性的影響后，我們推測(cè)由于二線治療方案中沿用了

6、一線方案中的NRTIs藥物3TC，一線治療失敗后累積的NRTIs耐藥可能以劣勢(shì)耐藥形式存在，使二線藥物方案中的NRTI類藥物3TC及TDF全部耐藥或者部分耐藥，從而導(dǎo)致二線治療失敗。本研究選取6名二線抗病毒治療6年但病毒學(xué)仍然失敗的患者，及9名長(zhǎng)期治療效果好的患者作為對(duì)照，應(yīng)用深度測(cè)序技術(shù)進(jìn)行耐藥檢測(cè)，力求充分挖掘這些患者的NRTIs相關(guān)耐藥信息，明確長(zhǎng)期二線抗病毒治療下NRTIs耐藥突變長(zhǎng)期累積變異的特點(diǎn)及規(guī)律，及其對(duì)療效的影響，為我

7、國(guó)制定長(zhǎng)期二線抗病毒藥物治療策略提供重要理論依據(jù)。
　　方法：采用回顧性隊(duì)列研究，選取的研究對(duì)象來自2009年8月-2010年1月于我國(guó)河南省尉氏縣建立的二線治療隨訪隊(duì)列，根據(jù)2007版《國(guó)家免費(fèi)艾滋病抗病毒藥物治療手冊(cè)》中艾滋病病人更換二線方案的入選標(biāo)準(zhǔn)，研究隊(duì)列共納入120名患者，所有患者均簽署知情同意書。從此符合換藥標(biāo)準(zhǔn)的120名患者中回顧性地選取15名患者作為研究對(duì)象，入選標(biāo)準(zhǔn)如下:①換藥前基線基本信息完整②二線藥物服藥依

8、從性＞90％③換藥前的常規(guī)基因型耐藥結(jié)果顯示對(duì)3TC或TDF耐藥④治療時(shí)間滿48個(gè)月，根據(jù)第48個(gè)月或第72個(gè)月血漿病毒學(xué)結(jié)果，將這15人分為病毒抑制組(VL＜400copies/ml):9名患者，病毒未抑制組(VL＞400copies/ml):6名患者。具體技術(shù)路線為分別采集上述15名患者基線點(diǎn)及治療失敗的6名患者VL＞400copies/ml的隨訪點(diǎn)血液標(biāo)本。收集15名患者人口學(xué)信息及各個(gè)血液標(biāo)本所對(duì)應(yīng)的CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、血漿

9、病毒載量及In-house耐藥檢測(cè)數(shù)據(jù)并進(jìn)行NGS(Next Generation Sequencing)基因型耐藥檢測(cè)。應(yīng)用FASTQC、Seqeuncher和Deepchek(@)-HIV等軟件對(duì)NGS數(shù)據(jù)進(jìn)行下游分析和HIV耐藥基因注釋。另外，選取構(gòu)建好的10個(gè)質(zhì)控質(zhì)粒標(biāo)本分別進(jìn)行Sanger測(cè)序和深度測(cè)序，以Sanger測(cè)序的結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估深度測(cè)序每個(gè)堿基位置的錯(cuò)誤率，并計(jì)算10個(gè)質(zhì)粒的平均錯(cuò)誤率，以平均錯(cuò)誤率95％可信區(qū)間

10、的下限作為Deepchek(@)-HIV軟件耐藥突變檢出的閾值。
　　結(jié)果：⑴基于NGS的HIV耐藥檢測(cè)明顯優(yōu)于傳統(tǒng)In-House方法，以Sanger測(cè)序的結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，NGS基因型耐藥檢測(cè)的錯(cuò)誤率為1.23(1.01-1.45)，并確定1％為Deepchek(@)-HIV軟件耐藥位點(diǎn)檢出的閾值;本研究共產(chǎn)生6.5G的數(shù)據(jù)量，94.5％數(shù)據(jù)處于Q30以上水平，整個(gè)耐藥檢測(cè)區(qū)平均每個(gè)氨基酸的序列覆蓋度為23457條reads;15

11、名患者共檢測(cè)到308個(gè)耐藥相關(guān)位點(diǎn)，其中NGS和In-House共同檢測(cè)到175個(gè)耐藥位點(diǎn)，NGS額外檢測(cè)到127個(gè)耐藥位點(diǎn)。⑵更換二線抗病毒藥物前，病毒抑制組和未抑制組基線人口學(xué)信息、血漿病毒載量及CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)顯著性差異。⑶更換二線藥物前，病毒抑制組NRTIs耐藥突變多于未抑制組，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異水平(P=0.07);嚴(yán)重影響3TC和TDF藥物敏感性的M184V、K65R位點(diǎn)僅在病毒抑制組中被發(fā)現(xiàn)，而低水平復(fù)制的F77L在兩

12、組均有發(fā)現(xiàn);另兩類藥物NNRTI和PI相關(guān)耐藥位點(diǎn)在兩組未見顯著性差異。⑷6名長(zhǎng)期治療失敗患者個(gè)體水平的縱向隨訪耐藥結(jié)果顯示，換藥前基線NRTIs藥物耐藥相關(guān)位點(diǎn)的種類和準(zhǔn)種比例隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)呈遞減趨勢(shì);NNRTIs耐藥位點(diǎn)同樣出現(xiàn)了下降趨勢(shì)但并不明顯，個(gè)別重要的NNRTIs耐藥位點(diǎn)K103S，G190A，Y181C一直維持到末次隨訪。未發(fā)現(xiàn)PIs主要耐藥位點(diǎn)。
　　結(jié)論：①深度測(cè)序檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，二線抗病毒藥物長(zhǎng)期治療失敗患者換藥