綿羊骨骼肌高表達miRNA靶基因文庫的高通量獲取及部分靶基因生物功能研究.pdf

1、為了掌握綿羊骨骼肌中miRNA的表達情況，深入探索其在綿羊骨骼肌發(fā)育過程中的表達特點及靶向調(diào)控的基因，進一步闡明miRNA對綿羊骨骼肌發(fā)育的調(diào)控機制，為優(yōu)質(zhì)肉羊品種的培育提供理論基礎(chǔ)及新的育種手段。本研究首先以薩?？搜蚬趋兰椴牧希褂眯酒夹g(shù)對其骨骼肌中miRNA的表達情況進行了檢測，并以此為基礎(chǔ)對綿羊骨骼肌中高表達miRNA從以下4個方面開展了深入研究：
　　首先，使用 PCR-SSCP（Polymerase chain re

2、action-single strand conformation polymorphism）技術(shù)對綿羊骨骼肌中高表達miRNA前體序列在4個不同產(chǎn)肉性能綿羊品種中的突變進行檢測，尋找在不同產(chǎn)肉性能綿羊品種間差異較大的突變，分析相關(guān)突變與綿羊產(chǎn)肉性能之間的關(guān)系。選擇7個對miRNA前體序列二級結(jié)構(gòu)能值影響不同的突變，構(gòu)建真核表達載體，通過真核細胞表達試驗及qRT-PCR檢測其對miRNA加工成熟的影響；
　　其次，使用qRT-PC

3、R技術(shù)檢測綿羊骨骼肌中高表達miRNA在綿羊胚胎期第40 d、60 d、80 d、100 d、120 d以及初生、6月齡和周歲綿羊骨骼肌組織中的表達變化，并分析其與綿羊骨骼肌發(fā)育之間的關(guān)系；
　　第三，使用本實驗室開發(fā)的建庫技術(shù)，構(gòu)建綿羊胚胎期第60 d和成年羊骨骼肌中高表達miRNA的靶基因文庫；
　　第四，以綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞為材料，采用 qRT-PCR和 Western Blot技術(shù)研究miR-133過表達和抑制表達對

4、綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞生長以及miR-133的4個候選靶基因表達的影響，分析miR-133對綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞生長的調(diào)控作用。
　　通過以上試驗，本研究得到了以下結(jié)果：
　　1.利用芯片技術(shù)在綿羊骨骼肌中共檢測到261個miRNA，其中58個為已報道的綿羊miRNA，其余203個在綿羊中尚未見報道；且這261個miRNA在同時期綿羊骨骼肌中的表達量不盡相同，其中有22個高表達的miRNA，其表達量占檢測到miRNA總表達量的89

5、％；
　　2.首次在16個miRNA前體序列中檢測到共計49個突變，其中包括41個單堿基突變和8個插入/缺失突變，另有6個miRNA前體序列沒有檢測到突變；對其中的3個突變在5個產(chǎn)肉性能不同的綿羊品種共計640份基因組樣品中進行了進一步研究，發(fā)現(xiàn)miR-133a前體序列的CCC插入/缺失突變與綿羊的產(chǎn)肉性狀高度相關(guān)；89.8%的突變對miRNA前體二級結(jié)構(gòu)和成熟加工有影響，且突變對二級結(jié)構(gòu)能值影響越大，突變位置離miRNA成熟序列

6、越近，對miRNA的成熟加工影響亦越大；
　　3.綿羊骨骼肌中22個高表達miRNA在綿羊骨骼肌發(fā)育的不同時期表達量會出現(xiàn)上調(diào)或者下調(diào)，其表達量按照4種基本的模式發(fā)生變化。胚胎期大部分miRNA出現(xiàn)了兩個低表達期，分別是胚胎期的40 d至60 d和120 d；
　　4.分別成功構(gòu)建了綿羊胚胎期和成年期骨骼肌高表達 miRNA靶基因文庫。胚胎期文庫和成年期文庫分別測序250個單克隆，得到246條和239條有效序列，陽性克隆率分

7、別達到85%和79%。分別有132條和124條ESTs序列與NCBI中unigene序列匹配，占靶基因文庫的53.66%和51.88%；
　　5. miR-133過表達對綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖具有抑制作用；miR-133在綿羊骨骼肌衛(wèi)星細胞中可靶向調(diào)控Rhoa，CDC42，TAGLN2基因的表達，造成其蛋白表達量極顯著下調(diào)，但是對MSN基因沒有調(diào)控作用。miR-133在Rhoa和TAGLN2的CDS區(qū)分別有一個靶位點，其余靶位點