氟蟲腈作用下斑馬魚miR-216和miR-499對(duì)cyb561d2調(diào)控作用的研究.pdf

1、miRNA主要通過與靶mRNA的3’端結(jié)合降解或抑制靶基因的翻譯，從而對(duì)靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。由于miRNA識(shí)別靶基因并不是一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，存在著幾個(gè)不同的miRNA聯(lián)合調(diào)控同一個(gè)靶基因的可能，而一個(gè)miRNA也可能調(diào)控多個(gè)靶基因。我們之前研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚中cyb561d2是miR-155的靶基因，并且在氟蟲腈（5-氨基-1-[2,6-二氯4-（三氟甲基）苯基]-4-[（三氟甲基）亞磺?；鵠-1H-吡唑-3-腈）的脅迫下cyb561d2

2、的表達(dá)受miR-155的調(diào)控。在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過Microcosm Targets預(yù)測發(fā)現(xiàn)cyb561d2有可能是miR-194a、miR-216b、miR-429和miR-499共同的靶基因，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這4個(gè)miRNAs分別與cyb561d2之間的關(guān)系。我們?cè)u(píng)估了氟蟲腈暴露下斑馬魚中這4個(gè)miRNAs的表達(dá)，研究4種miRNAs能否調(diào)控cyb561d2的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著氟蟲腈處理濃度的升高，斑馬魚中miR-216b和miR-4

3、99的表達(dá)量明顯下調(diào)，而miR-194a與miR-429的表達(dá)量卻沒有明顯變化。
　　為了解釋氟蟲腈處理后miRNA表達(dá)的變化，同時(shí)驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測的結(jié)果。我們通過重疊延伸PCR將cyb561d23’-UTR中miR-194a、miR-216b、miR-429和miR-499推定結(jié)合位點(diǎn)分別敲除，成功構(gòu)建了4個(gè)重組海腎熒光素酶載體，分別命名為pRL/S-K.O-194a、pRL/S-K.O-216b、pRL/S-K.O-429、

4、pRL/S-K.O-499。通過雙熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證了斑馬魚cyb561d23’-UTR中存在miR-216b和miR-499的結(jié)合位點(diǎn)，而并不存在miR-194a和miR-429的直接結(jié)合位點(diǎn)。
　　我們通過對(duì)ZF4細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-499 mimic后，檢測細(xì)胞中cyb561d2的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)cyb561d2在mRNA水平及蛋白水平都顯著下調(diào)，而轉(zhuǎn)染miR-499 inhibitor后，cyb561d2的mRNA水平及蛋白水

5、平則顯著上調(diào)，同樣的對(duì)ZF4細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-216b mimic后，cyb561d2的表達(dá)量下調(diào)，轉(zhuǎn)染miR-216b inhibitor后， cyb561d2的表達(dá)量則顯著上調(diào)，然而對(duì)ZF4轉(zhuǎn)染miR-194a或miR-429 mimic，細(xì)胞中cyb561d2 mRNA的表達(dá)并沒有發(fā)生明顯的變化。綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)cyb561d2是miR-216b和miR-499的靶基因，而不是miR-194a和miR-429的靶基因，而在氟蟲腈暴