阿托伐他汀和過氧化氫抑制血管收縮的機理.pdf

1、背景：動脈粥樣硬化是一種最終導致血管壁變硬變厚的血管損傷，高血壓是動脈粥樣硬化的主要危險因素之一，而血管功能紊亂是誘發(fā)高血壓的重要因素之一。
　　 某些病理條件下，如氧化應激(oxidative stress)，會促使血管平滑肌失去收縮能力，其本質是血管平滑肌細胞對血管活性物質失去正常的生理反應。長期的血管收縮功能喪失會致血管僵硬，對血壓產(chǎn)生影響。我們的研究初步證實，過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)能不可

2、逆性的抑制血管收縮，導致血管僵硬；而雷帕霉素(Rapamycin，Rapa)可以減緩此過程的發(fā)生。
　　 然而在另外一些情況，血管平滑肌對血管活性物質有比正常情況下更強的反應性，導致血管收縮過強，血管壓力升高，亦對血壓產(chǎn)生影響。我們的初步研究表明，他汀類降脂藥物阿托伐他汀(Atorvastatin，ATV)通過抑制血管平滑肌細胞myocardin的表達來降低動脈血管收縮能力，證明ATV具有潛在的通過抑制血管收縮強度來調控血壓的能

3、力。
　　 基于我們的初步研究結果，本論文主要包括兩個獨立的研究：ATV和H2O2各自抑制血管收縮的分子機理。
　　 第一部分ATV通過抑制myocardin表達降低血管平滑肌收縮
　　 目的：除了降血脂效應，他汀類(statins)藥物的多效性被廣泛關注，特別是其對心腦血管的保護作用，但機制尚不明確。在血管平滑肌細胞，他汀類藥物可抑制RhoA-ROCK信號通路抑制平滑肌的功能。Myocardin是血清反應因子(

4、SRF)的輔助因子，能上調平滑肌特異性收縮蛋白的表達，是平滑肌細胞分化的關鍵因子。RhoA-ROCK信號通路的激活可直接觸發(fā)平滑肌收縮，同時也誘導myocardin基因的表達。因此我們研究他汀類藥物的血管保護作用是否與抑制myocardin的表達有關。
　　 方法與結果：C57小鼠腹腔內連續(xù)注射ATV(i.p.20 mg/kg/天)5天后，分離心臟、胸主動脈及頸總動脈。蛋白質印跡法(Western blotting)檢測myoc

5、ardin及其下游平滑肌特異蛋白SMα-actin和SM22的表達；實時定量聚合酶鏈反應(Real-time PolymeRase chain reaction，RT-qPCR)檢測myocardin及其下游靶基因SMα-actin和SM22 mRNA表達。肌張力描計技術(Myography)檢測去內皮的胸主動脈血管環(huán)對氯化鉀(potassium chloride，KCl)、去氧腎上腺素(phenylephrine，PE)等血管活性物的

6、反應。同時，Myography)檢測未經(jīng)ATV處理的C57小鼠胸主動脈血管環(huán)ATV(500μM)及ROCK抑制劑Y-27632(10μM)孵育90 min前后對KCl和PE的反應。
　　 小鼠及人的主動脈平滑肌細胞系(mSMCs和 hSMCs)，0％血清培養(yǎng)基饑餓24 h后以KCl(60 mM)處理細胞24 h，RT-qPCR技術檢測可知KCl刺激myocardin及其下游靶基因SMα-actin和SM22 mRNA表達；這種刺

7、激效應能被ATV(1μM，10μM)抑制。甲羥戊酸(Meva，300μM)，香葉基香葉基焦磷酸酯(GGPP，1μM)可逆轉ATV的抑制，而法尼基焦磷酸酯(FPP，1μM)不能。ROCK抑制劑Y-27632(10μM)可模擬ATV對myocardin及其下游靶基因SMα-actin和SM22 mRNA表達的抑制效應，提示RhoA-ROCK通路與之有關。以Triton X-114萃取法、超速離心、Pull-down及Western blot

8、ting技術檢測，ATV(100μM)處理的hSMCs的RhoA的法尼基化、胞膜轉位及活化均明顯降低，而Meva(300μM)可逆轉該作用。
　　 第二部分H2O2通過Rapa敏感機制誘導血管平滑肌收縮抑制
　　 目的：氧化應激能使血管順應性降低，在血管老化中扮演了重要角色。Rapa是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin，mTOR)特異性的抑制劑。而Rapa具有延長小

9、鼠壽命、減緩衰老的作用。因此，我們通過Rapa研究H2O2對小鼠動脈血管收縮抑制的機理。
　　 方法與結果：用Myography技術檢測小鼠胸主動脈及腸系膜動脈(阻力血管)血管環(huán)暴露在H2O2(200μM)3h前后KCl(50 mM)和PE(1μM)誘導收縮的變化。H2O2不可逆性的完全抑制血管環(huán)的收縮功能；若提前20 min加入雷帕霉素(20μM)，血管環(huán)的收縮能力被部分保留；蛋白合成抑制劑放線菌素D(Act D，1μM)和基

10、因轉錄抑制劑環(huán)孢素(CHX，10μM)不具有保護作用；而鈣調神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)的抑制劑環(huán)孢素A(CsA，1μM)和FK506(1μM)能模擬Rapa的保護作用。
　　 蛋白印跡分析法(Western blotting)顯示H2O2處理動脈環(huán)的mTORC1下游底物40s核糖體蛋白S6激酶(S6K)和真核細胞啟動因子4E結合蛋白(4EBP1)的磷酸化未增加，提示H2O2對mTOR通路的激活未通過mTORC1

11、，而可能與mTORC2有關。H2O2抑制的平滑肌肌球蛋白輕鏈20 kD亞基(MLC20)的磷酸化，而該作用能被Rapa部分阻斷。
　　 CaN活性測定顯示，H2O2能增加CaN的活化，該作用可被雷帕霉素所抑制。
　　 結論：基于以上兩方面的研究，我們認為：(1)ATV通過抑制myocardin的表達，降低血管平滑肌收縮能力：該機制與RhoA-ROCK通路有關。該研究提示ATV通過對血管收縮能力的抑制，可能成為他汀類藥物治