阿托伐他汀和過氧化氫抑制血管收縮的機(jī)理.pdf

1、背景：動脈粥樣硬化是一種最終導(dǎo)致血管壁變硬變厚的血管損傷，高血壓是動脈粥樣硬化的主要危險因素之一，而血管功能紊亂是誘發(fā)高血壓的重要因素之一。
　　 某些病理?xiàng)l件下，如氧化應(yīng)激(oxidative stress)，會促使血管平滑肌失去收縮能力，其本質(zhì)是血管平滑肌細(xì)胞對血管活性物質(zhì)失去正常的生理反應(yīng)。長期的血管收縮功能喪失會致血管僵硬，對血壓產(chǎn)生影響。我們的研究初步證實(shí)，過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)能不可

2、逆性的抑制血管收縮，導(dǎo)致血管僵硬；而雷帕霉素(Rapamycin，Rapa)可以減緩此過程的發(fā)生。
　　 然而在另外一些情況，血管平滑肌對血管活性物質(zhì)有比正常情況下更強(qiáng)的反應(yīng)性，導(dǎo)致血管收縮過強(qiáng)，血管壓力升高，亦對血壓產(chǎn)生影響。我們的初步研究表明，他汀類降脂藥物阿托伐他汀(Atorvastatin，ATV)通過抑制血管平滑肌細(xì)胞myocardin的表達(dá)來降低動脈血管收縮能力，證明ATV具有潛在的通過抑制血管收縮強(qiáng)度來調(diào)控血壓的能

3、力。
　　 基于我們的初步研究結(jié)果，本論文主要包括兩個獨(dú)立的研究：ATV和H2O2各自抑制血管收縮的分子機(jī)理。
　　 第一部分ATV通過抑制myocardin表達(dá)降低血管平滑肌收縮
　　 目的：除了降血脂效應(yīng)，他汀類(statins)藥物的多效性被廣泛關(guān)注，特別是其對心腦血管的保護(hù)作用，但機(jī)制尚不明確。在血管平滑肌細(xì)胞，他汀類藥物可抑制RhoA-ROCK信號通路抑制平滑肌的功能。Myocardin是血清反應(yīng)因子(

4、SRF)的輔助因子，能上調(diào)平滑肌特異性收縮蛋白的表達(dá)，是平滑肌細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子。RhoA-ROCK信號通路的激活可直接觸發(fā)平滑肌收縮，同時也誘導(dǎo)myocardin基因的表達(dá)。因此我們研究他汀類藥物的血管保護(hù)作用是否與抑制myocardin的表達(dá)有關(guān)。
　　 方法與結(jié)果：C57小鼠腹腔內(nèi)連續(xù)注射ATV(i.p.20 mg/kg/天)5天后，分離心臟、胸主動脈及頸總動脈。蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測myoc

5、ardin及其下游平滑肌特異蛋白SMα-actin和SM22的表達(dá)；實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PolymeRase chain reaction，RT-qPCR)檢測myocardin及其下游靶基因SMα-actin和SM22 mRNA表達(dá)。肌張力描計(jì)技術(shù)(Myography)檢測去內(nèi)皮的胸主動脈血管環(huán)對氯化鉀(potassium chloride，KCl)、去氧腎上腺素(phenylephrine，PE)等血管活性物的

6、反應(yīng)。同時，Myography)檢測未經(jīng)ATV處理的C57小鼠胸主動脈血管環(huán)ATV(500μM)及ROCK抑制劑Y-27632(10μM)孵育90 min前后對KCl和PE的反應(yīng)。
　　 小鼠及人的主動脈平滑肌細(xì)胞系(mSMCs和 hSMCs)，0％血清培養(yǎng)基饑餓24 h后以KCl(60 mM)處理細(xì)胞24 h，RT-qPCR技術(shù)檢測可知KCl刺激myocardin及其下游靶基因SMα-actin和SM22 mRNA表達(dá)；這種刺

7、激效應(yīng)能被ATV(1μM，10μM)抑制。甲羥戊酸(Meva，300μM)，香葉基香葉基焦磷酸酯(GGPP，1μM)可逆轉(zhuǎn)ATV的抑制，而法尼基焦磷酸酯(FPP，1μM)不能。ROCK抑制劑Y-27632(10μM)可模擬ATV對myocardin及其下游靶基因SMα-actin和SM22 mRNA表達(dá)的抑制效應(yīng)，提示RhoA-ROCK通路與之有關(guān)。以Triton X-114萃取法、超速離心、Pull-down及Western blot

8、ting技術(shù)檢測，ATV(100μM)處理的hSMCs的RhoA的法尼基化、胞膜轉(zhuǎn)位及活化均明顯降低，而Meva(300μM)可逆轉(zhuǎn)該作用。
　　 第二部分H2O2通過Rapa敏感機(jī)制誘導(dǎo)血管平滑肌收縮抑制
　　 目的：氧化應(yīng)激能使血管順應(yīng)性降低，在血管老化中扮演了重要角色。Rapa是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin，mTOR)特異性的抑制劑。而Rapa具有延長小

9、鼠壽命、減緩衰老的作用。因此，我們通過Rapa研究H2O2對小鼠動脈血管收縮抑制的機(jī)理。
　　 方法與結(jié)果：用Myography技術(shù)檢測小鼠胸主動脈及腸系膜動脈(阻力血管)血管環(huán)暴露在H2O2(200μM)3h前后KCl(50 mM)和PE(1μM)誘導(dǎo)收縮的變化。H2O2不可逆性的完全抑制血管環(huán)的收縮功能；若提前20 min加入雷帕霉素(20μM)，血管環(huán)的收縮能力被部分保留；蛋白合成抑制劑放線菌素D(Act D，1μM)和基

10、因轉(zhuǎn)錄抑制劑環(huán)孢素(CHX，10μM)不具有保護(hù)作用；而鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)的抑制劑環(huán)孢素A(CsA，1μM)和FK506(1μM)能模擬Rapa的保護(hù)作用。
　　 蛋白印跡分析法(Western blotting)顯示H2O2處理動脈環(huán)的mTORC1下游底物40s核糖體蛋白S6激酶(S6K)和真核細(xì)胞啟動因子4E結(jié)合蛋白(4EBP1)的磷酸化未增加，提示H2O2對mTOR通路的激活未通過mTORC1

11、，而可能與mTORC2有關(guān)。H2O2抑制的平滑肌肌球蛋白輕鏈20 kD亞基(MLC20)的磷酸化，而該作用能被Rapa部分阻斷。
　　 CaN活性測定顯示，H2O2能增加CaN的活化，該作用可被雷帕霉素所抑制。
　　 結(jié)論：基于以上兩方面的研究，我們認(rèn)為：(1)ATV通過抑制myocardin的表達(dá)，降低血管平滑肌收縮能力：該機(jī)制與RhoA-ROCK通路有關(guān)。該研究提示ATV通過對血管收縮能力的抑制，可能成為他汀類藥物治