As2O3聯(lián)合Canstatin基因治療對人肝癌HepG2細胞血管生成擬態(tài)的影響及機制研究.pdf

1、目的：以As2O3、Canstatin及二者聯(lián)合方案分別干預三維培養(yǎng)的肝癌HepG2細胞，觀察各干預因素對血管生成擬態(tài)（VM）形成能力（VM數(shù)量、長度及面積）的影響，探討其影響機制，為抗肝癌血管形成提供新策略和實驗依據(jù)。
　　方法：⑴CCK-8法確定As2O3（1、5、10、15、20μmol/L）對HepG2細胞的最適作用劑量；⑵RT-PCR法鑒定重組腺病毒；⑶流式細胞術(shù)檢測不同轉(zhuǎn)染復數(shù)（MOI=10、20、40、60、80）的

2、腺病毒轉(zhuǎn)染HepG2細胞（24h、48h、72h）的轉(zhuǎn)染率，western-blot檢測轉(zhuǎn)染細胞Canstatin和Caspase-3蛋白的表達；⑷體外基質(zhì)膠三維培養(yǎng)HepG2細胞，PAS染色法鑒定VM；⑸不同干預因素對HepG2細胞形成VM的影響，實驗分空白對照組、As2O3組(1/2IC50、IC50、2IC50)、Canstatin組、As2O3(1/2IC50、IC50)與Canstatin聯(lián)合組，各因素干預體外培養(yǎng)細胞12h后

3、種膠，分別于種膠0.5h、2h、12h、24h、48h、72h倒置顯微鏡觀察下拍照，記錄測量VM（環(huán)狀結(jié)構(gòu)）的數(shù)量、長度及面積。⑹RT-PCR實驗鑒定細胞中VE-cadherin、MMP-2、Caspase-3、PCNA的表達；⑺Western-blot檢測各因素干預體外培養(yǎng)細胞12h后VE-cadherin、MMP-2、Caspase-3、PCNA的表達變化。
　　結(jié)果：①經(jīng)SPSS17.0軟件計算得出As2O3作用HepG2細

4、胞72h的半數(shù)抑制濃度IC50(10μmol/L)為后續(xù)實驗最適用藥劑量；②PCR產(chǎn)物測序序列識別為人Canstatin基因；③確定2次、48h，MOI=80為后續(xù)實驗轉(zhuǎn)染方式。Western-blot檢測轉(zhuǎn)染細胞中Canstatin的表達為強陽性，Caspase-3的表達與對照組沒有差異；④三維培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)細胞種膠2h后開始變形、延伸并相互連接，12h時相鄰的細胞相互聚集成明顯的條索樣結(jié)構(gòu)，72h時邊緣逐漸光滑，細胞開始向上堆積生長，PA

5、S染色后HepG2細胞形成的環(huán)狀條索樣結(jié)構(gòu)被染成紫紅色；⑤不同方案處理細胞三維培養(yǎng)72h后，倒置顯微鏡50倍視野下拍照，圖片應用IPP軟件計算VM的長度、數(shù)量和面積，統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，VM的長度、數(shù)量和面積，在1/2IC50組分別為4.90±0.91，22.00±9.17，0.177±0.013，IC50組分別為2.70±1.04，2.00±1.41，0.079±0.006，與對照組8.34±0.91，48.67±8.08，0.309

6、±0.017比較P<0.01，1/2IC50組與IC50組比較P<0.05；Canstatin與As2O3聯(lián)合組能夠抑制VM，與對照組比較P<0.05，但聯(lián)合組與As2O3組比較P>0.05；Canstatin組與對照組比較P>0.05；⑥PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示，細胞中存在VE-cadherin、MMP-2、Caspase-3、PCNA的表達；⑦western-blot結(jié)果顯示，1/2IC50組VE-cadherin相對表達量為1.79

7、±0.13，IC50組為0.62±0.06，與對照組2.56±0.13比較差異有統(tǒng)計學意義P<0.05，1/2IC50組與IC50組MMP-2的相對表達量1.96±0.09、1.10±0.03與對照組2.79±0.13相比差異有統(tǒng)計學意義P<0.05，而凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和增殖相關(guān)蛋白PCNA的相對表達沒有差異P>0.05，Canstatin組各蛋白的相對表達與對照組相比P>0.05，聯(lián)合組能抑制VE-cadherin、MM