V-ATPase抑制劑對人肝癌HepG2細(xì)胞行為的影響及其機(jī)制.pdf

1、目的：本研究以人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞為實驗對象，通過探討V-ATPase抑制劑(PI-230)對腫瘤細(xì)胞增殖、生長和凋亡的影響，并通過對細(xì)胞周期、線粒體膜電位和cleaved-caspase-3的檢測初步探討抗癌的可能機(jī)制；同時以正常肝細(xì)胞株LO2為對照，評價(PI-230)的毒性作用。本研究意在為以腫瘤細(xì)胞pH調(diào)節(jié)機(jī)制為靶點的抗癌策略提供新的證據(jù)，為(PI-230)抗癌的臨床應(yīng)用提供實驗證據(jù)。
　　 方法：選擇肝細(xì)胞癌細(xì)胞株

2、HepG2和人正常肝臟細(xì)胞株LO2，分別進(jìn)行細(xì)胞同步化處理后，用細(xì)MTT法、細(xì)胞集落形成實驗和細(xì)胞存活率分析儀對細(xì)胞計數(shù)法來檢測PI-230對細(xì)胞生長、增殖的影響，且用流式細(xì)胞儀來檢測細(xì)胞DNA周期。運用流式細(xì)胞儀測AnnexinⅤ-FITC/PI檢測細(xì)胞早期凋亡率和Tunel法測晚期細(xì)胞凋亡率，用Western-Blot技術(shù)測caspase-3蛋白的表達(dá)和用流式細(xì)胞儀測線粒體膜電位電位。
　　 結(jié)果：①相對對照組，PI-230

3、作用24h后分別對HepG2和LO2細(xì)胞80μM組存活率沒有明顯影響(均p>0.05)，而對160μM、320μM和640μM組存活率均降低，(均p<0.05)，且隨濃度的增加存活率降低。②與對照組相比，PI-230作用14天后對HepG2細(xì)胞10μM、20μM、40μM、80μM和120μM組集落形成數(shù)和形成率均減少(均p<0.05)，且隨濃度增加集落形成數(shù)下降，120μM組基本沒有集落形成；對LO2細(xì)胞10μM和20μM組集落形成數(shù)

4、均沒有顯著影響(p>0.05)，而對40μM、80μM和120μM組集落形成減少(均P<0.05)，且隨濃度增加集落形成數(shù)下降，120μM組基本沒有集落形成。③PI-230分別作用1天、2天、3天、4天、5天和7天后，與對照組相比，對HepG2細(xì)胞作用1天、2天、3天、4天、5天和7天后，對40μM、80μM和120μM組細(xì)胞數(shù)均有明顯影響(均p<0.05)，且隨時間和濃度增加，差異越顯著，且對細(xì)胞倍增時間有影響即隨濃度增加倍增時間呈遞

5、增關(guān)系，而對LO2細(xì)胞40μM組細(xì)胞數(shù)沒有顯著差異(p<0.05)，而對80μM和120μM組均有顯著影響(均p<0.05)，即細(xì)胞數(shù)隨濃度增加顯著降低，且隨時間增加影響越來越顯著，同時對細(xì)胞倍增時間有影響即隨濃度增加倍增時間呈遞增關(guān)系。④PI-230作用48h后，相對對照組對人肝癌細(xì)胞40μM組細(xì)胞抑制率沒有明顯差異(p>0.05)，而80、120、160和200μM組均有明顯差異(均p<0.05)，且隨劑量增加而增大；對LO2，相對

6、正常對照組，40、80μM組均無明顯差異，而對120μM、160μM、200μM組均有顯著差異(均p<0.05)。⑤PI-230作用48h后，對HepG2細(xì)胞相對對照組，120μM、160μM和200μM組處于G0/G1期細(xì)胞百分比和PI值均明顯增加(均p<0.05)，而對LO2細(xì)胞均沒有明顯改變(p>0.05)。⑥PI-230作用24h后，與對照組相比，對HepG2細(xì)胞80μM組其早期凋亡率沒有明顯影響(p>0.05)，而對120μM

7、、160μM和200μM組均有明顯影響(均p<0.05)，但與藥物濃度沒有明顯的劑量關(guān)系；對LO2細(xì)胞80μM、120μM和160μM組沒有明顯影響(均p>0.05)，而對200μM組有明顯影響，存在顯著差異(p<0.05)。⑦與對照組相比，PI-230作用48h后，對HepG2細(xì)胞晚期凋亡率有影響，使120μM、160μM和200μM組凋亡率增加。⑧PI-230作用48h后，分別測得HepG2細(xì)胞200μM組cleaved caspa

8、se-3蛋白表達(dá)相對對照組增加(p<0.05)，而LO2細(xì)胞200μM組處理cleaved caspase-3蛋白表達(dá)未顯著增加(p>0.05)。⑨與正常組相比，PI-230作用48h后，對HepG2和LO2細(xì)胞160μM和200μM組線高粒體電位膜電位和低線粒體膜電位均存在顯著差異(均p<0.05)。
　　 結(jié)論：(1)V-ATPase抑制劑(PI-230)具有抑制人肝癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，作抗癌藥開發(fā)具有潛在的價值。(