小反芻獸疫(PPR)ELISA及PCR診斷方法的建立.pdf

1、小反芻獸疫(Peste des Petits Ruminants，PPR)是由副粘病毒科麻疹病毒屬小反芻獸疫病毒引起的一種山羊和綿羊的急性或亞急性病毒病，臨床上以高熱、壞死性胃炎、胃腸炎和肺炎為特征。該病首次報(bào)道是在科特迪瓦，現(xiàn)發(fā)生在撒哈拉以南和赤道以北的多數(shù)非洲國(guó)家，中東到土耳其的幾乎全部國(guó)家。近年來該病持續(xù)向東傳播，我國(guó)周邊的印度、尼泊爾等國(guó)家也先后爆發(fā)了小反芻獸疫。 我國(guó)與印度、尼泊爾等國(guó)家有很長(zhǎng)的邊境線，這些邊境地區(qū)有高

2、原、山地及荒地的存在，存在著多種野生小反芻獸，在周邊國(guó)家感染PPRV后，經(jīng)遷徙將PPRV存入我國(guó)的可能性很大。PPR爆發(fā)將會(huì)影響我國(guó)的養(yǎng)羊業(yè)，同時(shí)也會(huì)對(duì)包括2008年奧運(yùn)會(huì)吉祥物的藏羚羊在內(nèi)的多種瀕危野生動(dòng)物造成打擊。為防范小反芻獸疫傳入我國(guó)，應(yīng)首先建立小反芻獸疫的診斷技術(shù)。 PPR診斷方法主要包括血清學(xué)診斷方法和病原學(xué)診斷方法。血清學(xué)診斷方法中應(yīng)用最多的ELISA方法，而病原學(xué)診斷方法中使用最為廣泛的則是PCR方法。本論文先

3、后建立了以PPRV N蛋白為抗原的ELISA試驗(yàn)和以N蛋白為靶蛋白的RT-PCR技術(shù)。本論文主要包括以下幾方面的研究工作： 1、PPRV N基因的合成與N蛋白的表達(dá) 從GenBank中下載多株P(guān)PRV病毒的N基因片斷序列，用MegAlign軟件分析它們的進(jìn)化關(guān)系，選取PPRV Turkey2000株基因組全序列(序列號(hào)為AJ849636)作為模板，截取N基因CDS序列(108-1685)；根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好調(diào)整密碼子

4、，并改變基因編碼區(qū)內(nèi)NcoⅠ和HindⅢ的酶切位點(diǎn)處的堿基組成。確定序列后經(jīng)公司合成，獲取了PUC-PPRV-N質(zhì)粒：用NP1和NP2引物大量擴(kuò)增PPRV-N基因，并提取pET32-H質(zhì)粒。提取的pET32-H質(zhì)粒和回收的PPRV-N基因PCR產(chǎn)物用NcoⅠ和HindⅢ酶進(jìn)行雙酶切，并回收目的片段；在T4DNA連接酶的作用下，純化的PPRV-N基因和pET32-H載體進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建了含有PPRV N基因的重組質(zhì)粒pET32-PPRV

5、-N；將pET32-PPRV-N大腸桿菌菌種接于含氨卞青霉素(AMP)的LB固體培養(yǎng)基上，經(jīng)誘導(dǎo)后可以表達(dá)出分子量約65000的蛋白；表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western-blotting檢測(cè)，可鑒定為PPRV N蛋白。 2、PPRV N蛋白的純化與間接ELISA方法的建立 菌種經(jīng)37℃震蕩培養(yǎng)后，測(cè)OD值，當(dāng)OD值達(dá)到0.5-0.6時(shí)，加入IPTG終濃度為1mol/L，37℃經(jīng)4h誘導(dǎo)表達(dá)。將菌液離心，

6、菌體沉淀用1×binding buffer懸浮，超聲波裂解，離心取上清，加入已處理好的層析柱，以每h10倍柱體積的流量過柱。隨后分別用10倍體積1×Binding Buffer、6倍體積1×WashBuffer、6倍體積1×ELute Buffer洗滌層析柱，收集1×ELute Buffer的洗脫液，加入超濾管中進(jìn)行濃縮與除鹽，經(jīng)蛋白核酸測(cè)定儀上進(jìn)行濃度后將蛋白分裝保存?zhèn)溆谩?制備免疫血清，用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行標(biāo)定，按照標(biāo)定的

7、梯度稀釋后作為參考陽性血清。以PPRV N蛋白為抗原包被酶標(biāo)板，形成了最終的ELISA程序。PBS稀釋純化好的PPRV-N蛋白，使其終濃度為3ug/ml：37℃作用3h后4℃包被過夜，次日用0.1％BSA37℃封閉1h；待檢血清用0.1％BSA-PBST作1：40稀釋，加入包被板，37℃作用40min；酶標(biāo)蛋白G作1：10000稀釋后，加入包被板，37℃作用40min；加入TMB底物37℃作用15min后用H2OS4終止反應(yīng)；測(cè)定OD4

8、50值，計(jì)算每一樣品的S/P值并判定結(jié)果。 從山東省地方采集467份羊血清，使用建立的ELISA程序進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算不同血清的樣品OD450值/陽性參考血清OD450值(S/P)值， S/P值用平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算出其臨界點(diǎn)為0.27。同時(shí)應(yīng)用I-ELISA方法和C-ELISA方法檢測(cè)來自于疫區(qū)的69份血清。兩者之間的符合率為29.7％((8+47)/69)；與用以病毒裂解物為抗原、H蛋白的單抗為基礎(chǔ)的C-ELISA方法相比較

9、，我們的PPRV重組N蛋白間接ELISA方法的特異性為94％(47/50)，敏感性為42％(8/19)。 3、PPRV N基因的反轉(zhuǎn)錄RT-PCR程序的建立 培養(yǎng)含有PPRV N基因片斷的大腸桿菌JM109，使用堿裂解法提取小量PUC-PPRV-N質(zhì)粒，以N基因的前20個(gè)堿基作為上游引物(NP1)，最后20個(gè)堿基的反向序列作為下游引物(NP2)大量擴(kuò)增PPRV-N基因；使用小量膠回收試劑盒法回收PPRV-N基因，連接到p

10、GEM-T載體；將連接產(chǎn)物pGEM-T-PPRV-N轉(zhuǎn)化至E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，并使用藍(lán)白斑試驗(yàn)篩選重組質(zhì)粒，培養(yǎng)pGEM-T-PPRV-N大腸桿菌；用堿裂解法提取小量pGEM-T-PPRV-N質(zhì)粒，PCR鑒定后選用NdeⅠ對(duì)質(zhì)粒酶切，進(jìn)行線性化處理，用酚/氯仿法純化線性化質(zhì)粒；測(cè)定DNA含量后，用純化后的線性化質(zhì)粒作為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物純化后測(cè)定其含量，稀釋后使其拷貝數(shù)最終達(dá)到2μL中6×1010個(gè)，分裝凍存于

11、-80℃后即為RNA陽性對(duì)照。 用體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，以NP3和NP4作為上下游引物，對(duì)PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度、循環(huán)次數(shù)、Mg2+濃度、引物濃度等進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的PCR反應(yīng)條件為25μL體系。各反應(yīng)成分為2.5μL10×Taq酶緩沖液、2.0μL dNTP、1.0μL MgCl2、1.0μL NP3、1.0μL NP4、1.0μL模板、1.0μL AMV、1.0μL RNase、0.25μL Taq酶、14.25μL DEP

12、C水。PCR儀程序設(shè)置為42℃反轉(zhuǎn)錄40min；95℃預(yù)變性3min，然后95℃變性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸30sec，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)之后，72℃延伸7min。提取和犬瘟熱、新城疫病毒的RNA作為模板，以體外轉(zhuǎn)錄的模板作為陽性對(duì)照，結(jié)果僅見體外轉(zhuǎn)錄模板有擴(kuò)增，證實(shí)了試驗(yàn)的特異性。陽性對(duì)照的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用DEPC水進(jìn)行連續(xù)10倍倍比稀釋后，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果PPRV RT-PCR的敏感性為可以檢出拷貝數(shù)為40的P