小反芻獸疫基因免疫的研究.pdf

1、小反芻獸疫是由小反芻獸疫病毒（PPRV）感染引起的小反芻獸的一種急性或亞急性、烈性、接觸性傳染病，尤其是山羊和綿羊。該病以發(fā)熱、眼鼻分泌物、胃炎、腹瀉和肺炎為特征。根據(jù)該病毒與牛瘟、犬瘟熱和麻疹病毒相似這一特性，將PPRV分類為副粘病毒科麻疹病毒屬。該病毒由N/P/M/F/H/L六種蛋白組成，其中H、F蛋白在誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗體過(guò)程中起了非常重要的作用，其中中和抗體主要與H蛋白有關(guān)。N蛋白雖然擁有比較好的免疫原性，也不能抵抗病毒，但可以用于

2、診斷。該病于1942年在西非科特迪瓦首次報(bào)道。在隨后的10年內(nèi)已經(jīng)擴(kuò)散到撒哈拉以南和赤道以北的多數(shù)非洲國(guó)家，以及中東到土耳其的幾乎全部國(guó)家。2003年以后與中國(guó)西南邊界接壤的國(guó)家均有爆發(fā)流行，給當(dāng)?shù)卦斐闪司薮蟮慕?jīng)濟(jì)損失。2007年7月小反芻獸疫在我國(guó)西藏阿里爆發(fā)流行。目前我國(guó)研制的商品化小反芻獸的重組疫苗和弱毒疫苗均不能有效的防治該病，且完全依賴進(jìn)口。因此研究一種有效的新型基因工程國(guó)產(chǎn)化疫苗迫在眉睫。 本研究通過(guò)對(duì)2007年7月

3、從西藏阿里的小反芻獸疫病羊組織中提取PPRV RNA，進(jìn)行基因免疫的相關(guān)研究，結(jié)果表明：參考Genbank發(fā)表的小反芻獸疫的H、F序列，應(yīng)用Vector NTI軟件，設(shè)計(jì)五段引物，通過(guò)PCR方法分別擴(kuò)增兩段包含H抗原位點(diǎn)的片段和三段包含F(xiàn)抗原位點(diǎn)的片段，酶切后插入原核表達(dá)載體PET—28b中，經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序鑒定為陽(yáng)性質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化E．coil Rosetta并用SDS—PAGE和Western—Blotting觀察其表達(dá)情況，結(jié)果顯示

4、H蛋白的兩段抗原位點(diǎn)以及F蛋白的三段主要抗原位點(diǎn)均得到了高效表達(dá)。將表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后作為抗原包被ELISA板可以檢測(cè)到動(dòng)物體內(nèi)的病毒血清抗體；參考Genbank發(fā)表的小反芻獸疫的序列，針對(duì)小反芻獸疫N、H、F三個(gè)蛋白基因應(yīng)用Vector NTI軟件分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用PCR方法從病羊組織中分別擴(kuò)增N、H、F的ORF序列，酶切后插入真核表達(dá)載體pIRESlneo中。經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序鑒定為陽(yáng)性質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，24h后用熒光顯微鏡

5、觀察其體外表達(dá)的情況，結(jié)果顯示能在體外表達(dá)；提取四種真核表達(dá)陽(yáng)性質(zhì)粒：pIRES1—N、pIRESl—H、pIRES1—F和pIRES1—NF和空質(zhì)粒pIRESineo（陰性對(duì)照）進(jìn)行動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)。選擇十二只山羊，分成六組（在免疫之前分別從每只羊采集血液兩毫升）兩只為一組。每隔兩周免疫一次，共免疫五次。每次每只羊免疫1.5ml（質(zhì)粒濃度為20ng/ul），在每次免疫之前靜脈采血。免疫結(jié)束后用Western—Blotting和ELSIA檢